细胞融合技术研究进展
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摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。
关键词：细胞融合;机理;方法;应用
细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。
1细胞融合的机理
最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。
2细胞融合的方法
2.1生物法
自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。
2.2化学法
2.2.1盐类融合法
此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法
Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。
2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法)
加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。
2.3物理法
2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术
电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。
2.3.2激光融合技术
1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。
2.3.3空间细胞融合技术
植物细胞融合过程中由于地球重力的存在,有无液泡的原生质体密度差很大,异源细胞融合率低[8]。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中,在地面上由于无法排除地球重力的影响,要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。20世纪80年代以来,在空间材料科学的启发下,试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。
2.3.4离子束细胞融合技术。
20世纪80年代证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在,建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系,据此原理发展了该技术。离子束的可操纵性高,可用微束对细胞进行超微加工,有目的地切割染色体,通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的[9]。该项研究一旦成功,将改变传统的一对一细胞融合的弊端,减少供体细胞导入的染色体范围,使融合更具目的性,大大减少筛选的工作量,将是细胞融合研究的一大进步。
2.3.5非对称细胞融合技术。
即利用某种外界因素(如γ射线)辐照某一细胞原生质体,选择性地破坏其细胞核,并用碘乙酰胺碱性蕊香红6 G,处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体,选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这2个原生质体品系的细胞,实现所需胞质和细胞核基因的优化组合。实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线X 射线照射为实现供体亲本少数基因的转移,创造种间、属间杂种提供了可能性[10]。
3细胞融合的应用
3.1动物细胞融合技术的应用
3.1.1用于研究细胞的核质关系。
Prescott等1972年首先应用离心术结合细胞松弛素B分离哺乳类动物细胞的胞质体获得成功,为研究哺乳类细胞的核质关系、细胞质基因的转移开创了新途径[11]。
3.1.2用于揭示疾病发生的机制。
细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。Lattanzi等将细胞融合技术与免疫荧光、生化分析、电镜技术相结合,对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究并取得较大的进展[12]。细胞融合技术与显微技术相结合可以研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系,Aguilar等研究发现,多次跨膜蛋白Prm1在酵母细胞的结合现象中起重要作用,该蛋白缺陷的突变体不能完成质膜之间的识别与融合[13],这有助于了解禽流感病毒的致病机理。
3.1.3用于基因定位研究。
JP2杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与细胞的某一性状表达与否相联系,从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise等发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,利用这一特点可以对人染色体上的基因进行定位。
3.1.4用于衰老机制研究。
Tam等采用细胞融合的方法在干细胞研究中揭示了衰老的分子机制:衰老是一个可逆的过程,它决定于直接或间接控制端粒长度及端粒酶活性的生物分子之间的平衡作用,通过改变染色质的状态进而进行表观遗传修饰调节基因表达[14]。
3.1.5动物细胞融合用于动物育种
动物体细胞融合后,杂种细胞一般难以发育再生为一个个体,但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内,可培育出新的杂种。
3.1.6动物细胞融合用于生产单克隆抗体
Zou等应用细胞融合技术和酶连免疫技术成功制备出一种新基因Urg11的抗体[3]。单抗试剂盒可对一些过敏性疾病查找过敏源(抗原检测),癌症、性病、妊娠、妇女月经排卵等进行早期诊断。
3.1.7动物细胞融合用于细胞疗法
SCNT(Somatic cell nu-clear transfer)将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合,融合子进行有丝分裂形成囊胚,囊胚的内细胞团是多能干细胞,对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植,不仅解决了器官和组织来源问题,而且避免了宿主对外来物的免疫排斥。Lagutina等的研究工作解决了动物体细胞与去核卵细胞融合率低的问题[15]。
3.2植物细胞融合技术的应用
3.2.1基础理论研究
Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培养体系,增加了不对称杂交属内种间细胞融合率[16]。可以设想,细胞融合技术改善后,可把人参和冬虫夏草的细胞融合产生新的品种,并具备它们各自特有的药效。
3.2.2改善作物品质
杂种优势现象在生物界普遍存在,利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一,即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。核基因控制的雄性不育的保持系很难解决,而细胞质雄性不育的不育系、恢复系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到。
3.2.3培育抗逆植株
Shelley用马铃薯二倍体作亲本经过体细胞杂交得到抗科罗拉多马铃薯甲虫的四倍体体细胞杂种;Bastia等对耐霜冻的野生种和栽培种进行体细胞杂交,获得的所有体细胞杂种都比栽培种亲本耐霜冻,其中有3株比野生种亲本的耐性还高[17]。
3.2.4应用于种质保存和有用物质生产
目前可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗传物质引入原生质体,从而有可能引起细胞遗传性的改变,为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮提供可行的方法,还可应用于种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产[18]。
3.3微生物细胞融合技术的应用
微生物细胞融合技术一方面用于生物药品的生产,包括抗生素、生物活性物质、疫苗等;另一方面为发酵工业提供优良菌种,如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交,分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。
4目前存在的问题及前景
细胞融合的确切机理至今仍不清楚,融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等性状出现,此外,细胞融合也存在伦理方面的问题,如将人的细胞核植入牲畜细胞核内,难免会使牲畜遗传信息传入人的细胞核内,如果用于医疗,将是非常危险的。任何事物都是一把双刃剑:了解细胞与细胞融合的机理有望对诸如细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释,对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。人体皮肤细胞与动物卵母细胞融合有望克隆出人类胚胎,用于治疗性克隆研究,获取人类胚胎干细胞,再在体外诱导分化,克隆出人体全身所有组织和器官。
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细胞融合技术的应用与前景 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的 台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50～55)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的 方向发展。 1．细胞融合的意义 所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交口]。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视[2_引。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。 2．动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的用。动物体细
食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术
原生质体细胞融合技术 摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文： 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用
细胞融合技术的发展过程 生物方法融合：1957年，冈田善雄意外发现仙台病毒（HVJ），能诱导悬液中小鼠艾氏腹细胞（EAC）融合。然后Harris、Kada等用于诱导种间细胞融合，获得成功。 化学方法融合:1972年，卡尔森首先用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年K a o等，首先发现聚乙二醇（PEG）能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。 1975年Pentecorvo发现P E G也能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年，Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒。 电融合法电融合法:70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细 胞融合方法。1970年，Senda首先应用电脉冲，通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。 激光诱导卵细胞融合:激光诱导方法是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人在1988年首先应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。 典型试题解析
试题：回答下列关于细胞工程的问题。（1）如图是细胞融合的示意图， 据图回答。 ①若A、B是植物细胞，则在细胞融合之前已用处理过。用 聚乙二醇诱导融合之后，体系中会出现未融合的细胞，原因 是。 ②若A是小鼠骨髓瘤细胞，B是受到抗原刺激的B淋巴细胞，用灭活的 仙台病毒诱导融合之后，需要用特定的选择性培养基进行筛选。在该培 养基上，细胞和的细胞都会 死亡，只有融合的杂种细胞（杂交瘤细胞）能够生长。杂交瘤细胞不止 一种，原因是。 （2）植物组织培养有一项应用是培育“脱毒苗”，动物细胞培养需要 创造“无菌无毒的环境”，脱毒苗中的“毒”是指，“无菌无毒环境”中的“毒”是指。 （3）制备单克隆抗体有一项重要的应用是作为诊断试剂，例如“早早 孕诊断试剂盒”。“早早孕诊断试剂盒”通过检测被测试者尿液中人绒 毛膜促性腺激素的含量，从而判断被测试者是否怀孕，其起检测作用的 核心物质是。 （4）动物的培育过程中需要进行细胞核移植，早期的细胞 核移植操作会将供体细胞的细胞核取出，再植入去核的卵母细胞，但取 出细胞核的过程会对细胞核造成一定的损伤。后期的核移植操作是直接 将供体细胞注射到去核卵母细胞外的透明带位置，再通过电刺激的方法 诱导，从而实现供体细胞核进入去核卵母细胞。 【答案】：（1）①纤维素酶和果胶酶融合的成功率不是百分之 百②未融合的亲本融合的具有同种核小鼠脾脏中分离 的B淋巴细胞是多种 （2）病毒代谢废物 （3）抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体 （4）克隆供体细胞膜与去核卵母细胞膜融合 【解析】：植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体 在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术；单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞，再利用动物细胞融合技术将 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，经过两次筛选获得产生特定抗体的杂交 瘤细胞。据图分析，图示A细胞与B细胞融合，形成的C是正在融合的 细胞，D是杂种细胞。
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢腰椎融合术常用术式有哪些 导语：肯定有很多人没有听过腰椎融合术是什么，具体有哪些效果。其实，看到腰椎两个字，我们就应该明白它是为了治疗腰椎的。一个人的腰椎具有支撑 肯定有很多人没有听过腰椎融合术是什么，具体有哪些效果。其实，看到腰椎两个字，我们就应该明白它是为了治疗腰椎的。一个人的腰椎具有支撑整个上半身的作用，腰椎发生问题，肯定会导致身体出现故障。那么，腰椎融合常用术式有哪些呢，下面进行了介绍。 腰椎融合常用术式及其特征 腰椎融合技术多种多样，根据融合部位不同大体上分为3类：后侧融合术、后外侧融合术和椎体间融合术。 1.腰椎后侧融合术：后侧融合术是由Hibbs于1911年首次报道，所以又称为Hibbs融合术，是双侧椎板和关节突间的融合术，其适应证非常局限，只能在椎板保持完整的情况下方可应用。现在很少使用，已经基本上被淘汰。 2.腰椎后外侧融合术(Posterolateral lumbar fusion，PLF)：即横突间融合术，与Hibbs融合术相比，PLF适应证较广泛，曾一度作为腰椎融合的标准术式，但是其存在创伤大、椎旁肌肉损伤严重、不能有效恢复椎间隙高度和腰椎生理曲度、不能进行腰椎滑脱复位、不能有效恢复腰椎前柱的支撑功能、植骨床处理困难、需要植骨量多、融合率低、融合强度低和对植骨融合评价较困难等严重缺陷。 3.腰椎椎体间融合术(lumbar interbody fusion，LIF)：LIF是20世纪50年代Cloward首先报道。可以有效地恢复腰椎的前柱支撑功能和重建腰椎生理曲度，所以更加符合腰椎的生理功能。和其他融合技术相比，其植骨面积显著大，融合率明显增高，融合强度也显著提高，同 预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
#专题综述# 细胞融合技术的发展及应用* 霍乃蕊a,韩克光b (山西农业大学a.食品科学与工程学院;b.动物科技学院,山西太谷030801) 摘要:细胞工程是四大生物工程之一,细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上,另一方面体现在新方法上,再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段向操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。本文以细胞融合技术的发展历史为主线,对上述内容做了简要综述。 关键词:细胞融合技术;发展;应用 中图分类号:Q813.2 文献标识码:A 文章编号:100727146(2006)022******* C ell Fu si on T echn iqu e:its D eve l opm en t and App lica ti on s H U O N a i2ru i a,HA N Ke2guang b (Shanxi Agr i cu lt ura lUn i ve rs it y a.College of Food Sc i ence and Eng i neering; b.College ofAn i m a l Sc ience and Technol ogy,Ta i gu030801,Shanx,i Ch i na) Ab stra ct:C ell u l a r engi neer i ng i s o ne of t he f our techniques of biote chnolo gy,and as t he core of ce ll ular engi neering, the cell fusi on technique ha s acqu ired outstand i ng ach ieve m ents i n m any fields such as agr icu lt ure,m ed icine and envi2 ron m enta l protecti on.Its app licati on i s still i ncreasi ng i n nu m ber.The i m prove m ent of t he ce ll fusi on techn i que i nvol ves the fusi on agent,new m e t hods and the cells used i n fusi on.No w new cell fusi on m ethods are re sorti ng to the co m b i ned usage of phys i ca l and chem i ca lm ethods to deve l op a s i m p le and co nven i ent,easy quantificati on and a t t he sam e ti m e can i ncrease the fusi on rate.A ll these aspects were d i scussed i n th i s pape r centered aro und the h i story of the cell f usio n te ch2 n i que. K ey word s:ce ll fus i on techn i que;deve l op m ent;app licati on 细胞工程是生物工程主要组成之一,出现于20世纪70年代末至80年代初,是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合 第15卷第2期2006年4月 激光生物学报 ACTA LAS ER BI O LOGY SI NI CA Vo.l15No.2 Ap r.2006 *收稿日期:2005203210;修回日期:2005209222 基金项目:山西省科委攻关项目(04105523);山西省自然科学基金项目(20041094) 作者简介:霍乃蕊(1972)),女,博士,现为澳大利亚纽卡斯尔大学访问学者,主要从事生物工程方面研究. (电子信箱)sxndkgh@163.co m
第二章克隆技术 第三节动物的克隆----动物的细胞融合技术及其应用 【学习目标】 1.说出动物细胞融合技术的概念、原理及方法。 2.辨别细胞融合与细胞杂交。 3.简述单克隆抗体的制备过程。 【学习重难点】 1.重点：动物细胞融合技术的概念、原理及方法；辨别细胞融合与细胞杂交；单克隆抗体的制备过程。 2.难点：辨别细胞融合与细胞杂交；单克隆抗体的制备过程。 【课前导忆】 写下植物体细胞杂交（原生质体融合）的原理和诱导方法。 动物细胞克隆培养的方法和要求。 【课堂任务】 任务一： 请阅读p31，完成以下问题 细胞融合的概念： 细胞杂交的概念： 细胞融合的诱导方法： 选择下列材料，为制备针对肝癌细胞的单克隆抗体提供思路 原理： 动物细胞的融合物理： 诱导方法化学： 生物： 应用： 【课堂练习】 1、人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗 HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。下图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回 答： (1)制备单克隆抗体过程中要用到_________和__________技术。
(2)制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于________，使小鼠产生分泌相应 ________的淋巴细胞，此过程属于特异性免疫中的______________免疫。 (3)在细胞内DNA合成一般有两条途径，主途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存 在的情况下，经酶催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。 ①．利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其中添加的_________ 成分具有筛选杂交瘤细胞的作用。 ②．最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是___________________。 (4)此过程生产的单克隆抗体可以与______________特异性结合，从而诊断早孕。
椎间融合器注册技术审查指导原则 一、前言 椎间融合器作为骨科植入性医疗器械，是实现脊柱相邻椎间隙融合的主要植入物之一，其安全性和有效性直接影响相邻椎体骨性融合的效果。本指导原则旨在指导注册申请人对椎间融合器的产品注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则系对椎间融合器的一般要求，申请人应依据具体产品特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规和技术标准的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 二、适用范围 本指导原则涵盖的产品系植入于椎间隙并联合脊柱内固定植入物使用的预定形的非可降解椎间融合器。椎体切
除术（次全切及全切）中的椎体替代植入物，和特殊设计的产品如自稳定型、自撑开型、分体组合式、可吸收型等椎间融合器，可以参考本文的技术分析原理来制定适用的具体性能要求、试验方法、临床试验资料和使用说明书等相关注册资料。 三、技术审查要点 （一）注册单元的划分 椎间融合器临床预期用途较为统一，颈椎、胸腰椎产品可作为同一注册单元，不考虑微创、开放、前路、后路等脊柱减压手术术式区别。椎间融合器产品组件可包括主体、端盖（若有）、组件紧固螺钉（若有。不包括发挥脊柱内固定作用的椎弓根或椎体钉）等，各组件相互配套地使用于临床，且不同尺寸规格间配合关系较确定，故单一组件一般不作为独立注册单元进行申报。 （二）产品的研究资料 1.产品的基本信息 （1）产品各型号规格、各组件、各关键部位的结构图和几何尺寸参数（包括允差）。例如终板接触面的弧度、倾角及咬合齿的高度，植骨区、涂层和显影区的边界及在融合器中位置，主体的长宽高度，端盖及紧固螺钉的直径，网孔结构的几何尺寸等。结构图应以产品CAD设计工程图为蓝本，从整体外观、各维度剖面及侧面、局部细节明确
河北科技师范学院学报 第19卷第1期,2005年3月 Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19 No1.1M arch2005 植物细胞融合的研究进展(综述) 郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2 (1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。 关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定 中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05 细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。 自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。 1 原生质体的分离和培养 1.1 起始材料 起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。 1.2 基因型 同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。因此,现有 收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-12
细胞融合的原理与技术 摘要：细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。 1.细胞融合原理 细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。 细胞融合大体分三个阶段进行。第一阶段是制出细胞融合体。首先要用氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。第二阶段是融合子的鉴定。利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。第三阶段是培养融合细胞阶段。融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上，继续生长形成新植物。 1.1动物细胞融合 一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融
附件6 椎间融合器注册技术审查指导原则 一、前言 椎间融合器作为骨科植入性医疗器械，就是实现脊柱相邻椎间隙融合得主要植入物之一，其安全性与有效性直接影响相邻椎体骨性融合得效果。本指导原则旨在指导注册申请人对椎间融合器得产品注册申报资料得准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则系对椎间融合器得一般要求，申请人应依据具体产品特性确定其中内容就是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应得科学依据，并依据产品得具体特性对注册申报资料得内容进行充实与细化。 本指导原则就是对申请人与审查人员得指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能满足相关法规要求得其她方法，也可以采用，但应提供详细得研究资料与验证资料。应在遵循相关法规与技术标准得前提下使用本指导原则。 本指导原则就是在现行法规与标准体系以及当前认知水平下制定得，随着法规、标准体系得不断完善与科学技术得不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 二、适用范围 本指导原则涵盖得产品系植入于椎间隙并联合脊柱内固定
植入物使用得预定形得非可降解椎间融合器。椎体切除术（次全切及全切）中得椎体替代植入物，与特殊设计得产品如自稳定型、自撑开型、分体组合式、可吸收型等椎间融合器，可以参考本文得技术分析原理来制定适用得具体性能要求、试验方法、临床试验资料与使用说明书等相关注册资料。 三、技术审查要点 （一）注册单元得划分 椎间融合器临床预期用途较为统一，颈椎、胸腰椎产品可作为同一注册单元，不考虑微创、开放、前路、后路等脊柱减压手术术式区别。椎间融合器产品组件可包括主体、端盖（若有）、组件紧固螺钉（若有。不包括发挥脊柱内固定作用得椎弓根或椎体钉）等，各组件相互配套地使用于临床，且不同尺寸规格间配合关系较确定，故单一组件一般不作为独立注册单元进行申报。 （二）产品得研究资料 1、产品得基本信息 （1）产品各型号规格、各组件、各关键部位得结构图与几何尺寸参数（包括允差）。例如终板接触面得弧度、倾角及咬合齿得高度，植骨区、涂层与显影区得边界及在融合器中位置，主体得长宽高度，端盖及紧固螺钉得直径，网孔结构得几何尺寸等。结构图应以产品CAD设计工程图为蓝本，从整体外观、各维度剖面及侧面、局部细节明确产品得设计特征。带多孔涂
无缝克隆与基因融合 基因融合技术是基因功能研究的关键工具。准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法 前言 随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。 无缝基因融合及其应用 无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。这是获得杂交基因的理想情况。以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。 启动子和外显子研究 基因启动子含有许多调控元件。转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。 蛋白质功能研究和蛋白质工程 蛋白质由有功能结构域构成。为了阐述一个蛋白某个结构域的功能，需要构建该结构域删除或者被相似结构域替换的突变体。这种结构域删除或者互换实验将在很大程度上得益于相关元件的无缝融合，来消除有操作序列所带来的潜在的负面影响。更加概括地说，不同结构域的无缝融合对于蛋白质工程是非常重要的，包括获得新的杂交分子和抗体改造。对于抗体改造，互补决定区嫁接（CDR-grafting）和定点突变是经常要做的。嵌合体蛋白也可以通过內含肽介导的蛋白拼接和连接获得。只要含有內含肽的前体蛋白没有多余的序列，精确蛋白融合就可以实现。 蛋白质表达 标签和融合伴侣的使用促进了蛋白质的表达。它们赋予蛋白的可溶性和稳定性并促进接下来的目的蛋白的亲和纯化。在目的蛋白的活性不受到融合伴侣或者标签影响的情况下，整个融合蛋白可以直接用到接下来的研究中。对于酶学研究和测定，通常是这种情况。然而，在许多情况下，移除融合蛋白是必要的，这可以通过改造的蛋白酶酶切位点来完成。这个过程需要蛋白酶切位点和目的蛋白之间无缝的连接。为了进行功能研究，在一些情况下携带一个短标签（比如his标签）的融合蛋白被成功地结晶，移除这个标签是不必要的。然而，如果带有标签的蛋白无法结晶，就难以估量标签的影响，标签的切除通常是必要的。 在表达成熟和有活性蛋白的过程中，常常需要表达蛋白氨基酸序列与原来的一样。例如
细胞融合技术及其研究进展 摘要：自1958年Okada首次表明紫外灭活的仙台病毒可以诱导体外培养细胞融合形成多核体以来，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术，已在医药、环保、免疫学、医药、食品以及农业等领域的基础研究和应用开发。本文综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒（HVJ）诱导法、聚乙二醇（PEG）化学诱导法、电融合诱导法及激光诱导法的基本原理和研究进展。 关键词：细胞；细胞融合；细胞工程 1 引言 在细胞融合是 20 世纪发展起来的一种细胞工程技术，可以在一定的条件的诱导下使两个或多个细胞(原生质体) 相互接触，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，从而形成杂种细胞。细胞融合所形成的新细胞( 杂合细胞) 得到了来自两个父本细胞的遗传物质，因而具有新的遗传学或生物学特性[1]。细胞融合逐渐成为细胞工程的一项核心技术，它不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、免疫学、医药、食品以及农业等领域具有广泛应用价值[2]。它已成为杂交育种、单克隆抗体制备、动物克隆以及抗癌疫苗研发等现代生物医学研究中的一项关键技术。 随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著，本文就其现有的研究情况进行讨论。 2 细胞融合技术 2.1仙台病毒(HVJ)诱导法 2.1.1仙台病毒诱导法原理 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由仙台病毒引起的细胞融合成多核细胞的现象[2]。由于仙台病毒诱导细胞融合法较简便,特别是许多种类的细胞对其敏感,所以常选用仙台病毒作为细胞融合的诱导剂。仙台病毒属于RNA病毒,其质膜表面存在两种糖蛋白,一种是HANA 蛋白,它具有凝集红细胞能力和神经氨酸普酶活性。一种是F蛋白,它具有质膜融合能力(质膜和细胞膜融合的能力)、细胞融合能力和溶血能力。仙台病毒诱导细胞融合的能力与共质
摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化研究，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。 关键词：方法动物细胞融合植物细胞融合应用 1.细胞融合常用的技术 1.1生物法 仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发现了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象+ 冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法 1.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。1.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 1.2.2聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 1.3物理法 1.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。 1.3.2激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟[7]。该法可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。 2细胞融合技术的最新进展
细胞融合技术研究进展 年级专业 课程 学生姓名 学号 指导教师
摘要：人们对细胞融合的机理、融合方法的了解越来越多，其应用范围也越来越广。对细胞融合的机理、方法、应用及目前存在的问题进行了综述。 关键词：细胞融合;机理;方法;应用 细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育[1]、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段[2],而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体[3-4]及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。 1细胞融合的机理 最近研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞内的膜泡融合有许多相似之处,即带包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域,即都具有a-螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程(伴随有构象的变化)的。细胞内的膜泡融合也是如此,其相关融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不全具有a-螺旋结构,提示a-螺旋并非融合所必需[2]。 2细胞融合的方法 2.1生物法 自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。 2.2化学法 2.2.1盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.2.2高钙和高pH值融合法 Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。 2.2.3聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合[5]。此法比病毒更易制备和控制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。 2.3物理法 2.3.1电脉冲诱导细胞融合技术 电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年代,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下观察融合全过程[6]。
细胞融合的应用 细胞融合技术已在农业、工业、医药等领域取得了开创性的研究成果，应用领域不断扩大。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物菌种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。 人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象，首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞，紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合，随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了利用灭活病毒促进动物异种细胞融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备较为困难，限制了植物细胞融合技术的发展，因此植物细胞融合的起步较动物细胞融合要迟10年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后，才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因，人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便的化学物质PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，但在PEG诱导细胞融合的有效的浓度范围内(50%～55%)对细胞毒性很大，因此人们又找到了新的方法来替代PEG，这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术以及空间融合技术等。纵观细胞融合技术的发展历史，该技术的不断改进首先表现在融合剂上，从致癌活病毒到灭活病毒再到化学物质，其次体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法一般采用将化学法和物理法结合起来进行，如将磁、超声、机械等和激光、电相结合，同时添加化学剂以便进一步提高融合率，细胞融合的方法和手段始终朝操作方便、简单，便于量化研究，同时融合率又能得到不断提高的方向发展 动物细胞融合技术 动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。 2.1 用于基因定位和绘制人类基因图谱 JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。 2.2 用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗 一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法[4]。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效[5-9]，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用[2]，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的