免疫组化技术在妇科的临床应用
欧阳光明（2021.03.07）
免疫组化的基本原理
免疫组化是免疫组织化学技术的简称。它是应用抗原、抗体特异性结合的原理，使用已知的抗体在病理切片上与相应的抗原结合，然后把结合产物应用组织化学的方法显现出来，使之可以在显微镜下观察得以确认。通常使用的显色剂为联苯胺，结合的抗体显示为棕色颗粒，所以把免疫组化成为“棕色革命”。
组成人体细胞分为若干种，如：上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、血细胞等，每种细胞都有其特殊的结构物质，每种细胞都有其特异功能，每种功能又有其物质基础。如：鳞状上皮细胞通过角化物可以防止机体水份的蒸发和外界病原体的侵入，肌肉可以通过肌动蛋白使自己收缩。突触素可以传导神经兴奋，某些器官借以实现其功能的激素受体，载有遗传物质的DNA全段——基因等。现在人们都可以把这些物质纯净的分离出来，并把它们作为抗原免疫大鼠和家兔，使之产生相应的抗体，人们再把每种抗体分离纯化，就得到我们免疫组化应用的抗体。我们把这些抗体作用于病理切片，然后再通过染色，如果切片上有这种抗体对应的抗原，就会在切片上出现棕色颗粒，如果没有棕色颗粒，就说明没有这种抗体的抗原，在显微镜下就一目了然。
免疫组化标记在妇科肿瘤的应用及其意义
免疫组化以它的特异性和敏感性，结合组织学上的定位性已成为
多种肿瘤病理形态学诊断的新手段。这里需要说明的是虽然目前具有诊断价值的肿瘤标记物有数百种之多，但至今还没有发现人体肿瘤的特异性抗原，也就是说还没有任何一种抗体能100％地确诊一种肿瘤。
尽管如此，人们正是得到了一些与肿瘤相关的抗原，存在于肿瘤细胞的胞核、胞浆和胞膜上，它的存在或量变可以提高肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生，细胞分化、细胞功能，以有助于肿瘤的诊断，鉴别诊断、分类，判断预后和指导临床治疗。
目前具有诊断价值的肿瘤标记物虽已有数百种，但在临床病理诊断常用的有50余种，其标记物有以下类型：
一、肿瘤相关抗原
这种抗原只存在肿瘤组织中，正常组织内没有或含量甚微。或其为几种类型肿瘤所共有，故又称为肿瘤群体抗原，对判断肿瘤的良、恶性和起源均有一定帮助
CA125
对卵巢上皮性肿瘤都有一定的表达，但主要对浆液性肿瘤阳性表达，卵巢粘液性腺癌CA125 不表达。可以用于这两种肿瘤的鉴别诊断。CA125 对子宫内膜样肿瘤透明细胞癌，未分化癌上皮成份也是阳性表达。
CEA癌胚抗原
广泛存在于各种上皮性肿瘤，大多数卵巢浆液性肿瘤不表达，而卵巢粘液性肿瘤表达，在子宫内膜样腺癌，透明细胞癌，勃勒纳氏瘤CEA都有不同程度的表达，在胃肠道恶性肿瘤中CEA也为阳性
表达，所以卵巢库肯勃氏瘤CEA也是阳性表达。
AFP甲胎蛋白
是胚胎卵黄囊细胞，胚胎肝细胞和胎儿肠道细胞合成的一种糖蛋白，主要用于肝癌的诊断，在卵巢内胚窦瘤、胚胎性癌，恶性畸胎瘤都为阳性表达。
二、细胞结构抗原
这种抗原可存在于正常组织和肿瘤组织中，为某些组织细胞群所特有，对判断肿瘤起源有重要意义
CK7:
主要标记腺上皮和移行上皮。卵巢、肺、乳腺上皮CK7阳性表达。而结肠，前列腺和胃肠道上皮CK7阴性表达。可用于卵巢癌与胃肠道癌的鉴别诊断。
CK20:
主要标记胃肠道上皮、尿道上皮。卵巢粘液性囊腺癌CK20为阳性表达。子宫内膜腺癌、宫颈鳞癌、乳腺癌、肺癌和卵巢非粘液性肿瘤CK20均不表达。
desmin 结蛋白
为中间丝蛋白之一，分布于正常平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和肌上皮细胞及其肿瘤中。结蛋白在良性肌源性肿瘤是强阳性表达，而在平滑肌肉瘤中表达率仅为50％，另外在平滑肌瘤中结蛋白与波形蛋白Vimentin（是表达间叶组织来源的肿瘤，上皮来源肿瘤不含此蛋白，用于癌与肉瘤的鉴别，恶黑与癌的鉴别等）的表达呈反向关系，分化越好结蛋白阳性反应越强，波形蛋白阳性反应
弱或阴性；反之，分化越差，结蛋白反应弱或阴性，而波形蛋白反应越强。另外含有肌源成份的癌肉瘤，恶性中胚叶混合瘤，畸胎瘤中也存在结蛋白
S-100
是一种可溶性酸性蛋白，主要存在于神经组织、垂体、唾液腺等组织，是神经性肿瘤的主要标记。在恶黑及脂肪肉瘤为阳性表达SMA 肌动蛋白
是一种标记平滑肌瘤的蛋白，主要用于诊断平滑肌瘤、血管平滑肌瘤，平滑肌肉瘤以及肌上皮细胞。在乳腺肿瘤中以此抗体检测导管上皮肌上皮细胞阳性与否来判断乳腺肿瘤的良、恶性。
三、可用于某些生殖细胞来源的肿瘤和妊娠有关的肿瘤的诊断，常用的有：
内分泌激素及其受体抗原
包括肽类激素和类固醇激素两种，以肽类激素抗原应用较多，常用有胰岛素、高血糖素、胃泌素、生长抑素、降钙素等。
类固醇激素有雌激素、孕酮、睾酮等。但此类激素在组织切片中保留困难，且在组织内有多种结构类似的激素前体，不仅染色效果不好，且难以正确判断。所以多检测其激素受体。如：ER（雌激素受体）、PR（孕激素受体）
四、肿瘤中病毒抗原
HPV（人乳头状瘤病毒）特别是HPV16、18是宫颈癌主要致病病毒，亦可用于头颈部癌、前列腺癌和食管癌的研究
HIV（人类免疫缺陷病毒）即艾滋病病毒，表达于淋巴细胞、单核
细胞、巨噬细胞、滤泡树突状细胞和HIV感染的神经胶质细胞，主要用于艾滋病的研究.另外还有HSV（单纯性疱疹病毒等）
五、作为判断预后的标记抗体
C-erbB-2
是一种癌基因蛋白质，存在于细胞膜上，该蛋白可加速细胞的运动，参与细胞浸润和转移调节。在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌阳性表达提示预后差。特别是乳腺癌阳性表达具有独特的预后价值，阳性表达者复发及转移率高，无瘤生存期及总生存期短。宫颈腺癌C-erbB-2 阳性表达者盆腔淋巴转移率和宫颈深肌层侵犯率高于阴性组。
P53（肿瘤抑制基因）
P53蛋白也是现代分子生物学中研究最多的蛋白质之一， P53蛋白除具有细胞生长阻滞作用外，同时还参与细胞DNA的损伤与修复、细胞生长与分化、诱导细胞调亡的过程，目前认为P53是生命科学领域中最重要的蛋白质分子。
P53是肿瘤抑制因子，但由于失活、突变使蛋白结构发生变化，这在许多恶性肿瘤中可以见到P53基因的突变，特别是结肠癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、宫体癌、食道癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及膀胱癌尤为常见。另外对骨肉瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤及白血病等恶性肿瘤细胞中也可见到。研究证明，P53突变与肿瘤大小正相关，与分化程度、病人的总生存期和无瘤生存期呈负相关。P53突变肿瘤复发率和死亡率明显高于阳性者。且P53突变与肿瘤血管侵袭呈明显相关。
在多种恶性肿瘤中突变性P53蛋白表达水平升高，用免疫组化可以检测到，所以我们仍以P53阳性表达来预测患者的预后、术后易复发等指标。
P53阳性表达与癌前病变的关系也极为密切，在宫颈和食管非典型增生中均可检测出P53蛋白。
PCNA（增殖细胞核抗原）
是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽。PCNA阳性表达与细胞增殖活性有关，可做为细胞增殖状态的一个重要指标。在恶性肿瘤中PCNA阳性表达提示有肿瘤浸润、转移和临床预后不佳。
Ki-67
是一种与细胞增殖有关的核抗原，位于胞核中。Ki-67增殖指数高低即阳性表达与许多肿瘤的分化程度、浸润、转移及预后密切相关，因此被广泛做为各种恶性肿瘤必检项目之一。
ER、PR
是乳腺癌、子宫内膜腺癌、宫颈癌、卵巢癌等必检项目之一。ER、PR阳性与否与病人术后化疗方案的选择和内分泌治疗以至于肿瘤的复发、转移、预后都密切相关。ER、PR阳性者，内分泌、化疗治疗效果好，复发、转移率少，缓解期长，生存率高。
六、肿瘤多耐药基因
在临床肿瘤治疗中，经常有这样的情况：同一种肿瘤，使用同一个治疗方案，或同一个病人，化疗之初和化疗后期，其效果迥异。这种情况决定性原因是肿瘤细胞内是否存在或产生了多耐药性。多
耐药性基因编码蛋白可以把化疗药从细胞内泵到细胞外，从而避免了化疗药对细胞的破坏。
研究表明，癌细胞有六种耐药途径，通俗点说：化疗药物要制服、杀灭癌细胞，而癌细胞有强大对抗办法，使化疗药物奈何不了它，这样，癌细胞仍可肆无忌弹地增生，最后达到危及健康与生命的目的。所以每一位化疗病人在治疗前都应该检查肿瘤的耐药性，如果阳性，可以使用逆转剂，提高肿瘤细胞对化疗物的敏感性
Pg糖蛋白
它是多耐药基因产物，作用“药泵”功能，引起癌细胞产生耐药。容易产生耐药抗药药物主要有长春新碱、长春花碱、阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、紫杉醇、VP16等。阳性表达（++）以上有意义，对肿瘤病人选择化疗方案和愈后判断具有重要的临床意义。
MRP3
多耐药相关蛋白，主要用于非Pg糖蛋白肿瘤细胞系的肿瘤耐药性的研究。容易产生耐药的抗药药物主要有阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、长春新碱、长春花碱、 VP16。
常见妇科肿瘤免疫组化检测应用举例
日常工作中根据每位病人，不同肿瘤类型从诊断、鉴别诊断、探讨组织来源、内分泌治疗及化疗前肿瘤多耐药基因及病人的愈后等多方面选择一组免疫组化抗体以达到辅助诊断的目的。
子宫内膜腺癌
ER、PR、Ki-67 、P53（浆液性乳头状腺癌过表达）、
PCNA 、PTEN、MRP3、Pg糖蛋白
PTEN是一种肿瘤抑制基因，在维持细胞增殖、分化和调亡平衡起着重要作用，该基因在许多肿瘤表现突变和丢失。子宫内膜腺癌的发生一部分是与持续与过多雌激素有关，病人有不排卵、不孕及子宫内膜增生过长的病史。PTEN常为阳性表达，提示预后较好。有些内膜癌患者无雌激素增高，有正常排卵，卵巢功能正常。很多绝经多年的老年妇女，癌周内膜多显萎缩，说明无雌激素影响，这种内膜腺癌发生机制尚不清楚，PTEN的阴性表达提示肿瘤恶性程度高，预后差。
子宫平滑肌肉瘤
SMA 、P53、结蛋白、波形蛋白、PCNA、CD10、Ki-67、MRP3、 Pg糖蛋白。
子宫内膜间质肉瘤
ER、PR、CD10、波形蛋白、desmin 、SMA、P53、Ki-67、MRP3、 Pg糖蛋白
宫颈浸润性鳞癌
广谱CK、 P16、 HPV16、 P53、 Ki-67、 MRP3 Pg糖蛋白。
P16是一种重要的抑癌基因，当P16基因突变和丢失时细胞增殖失控使细胞无限制增殖而发生肿瘤。在宫颈上皮内瘤变及癌的发生是以P16阳性表达为特征，这与宫颈上皮内瘤变与宫颈癌是由HPV 感染所造成细胞不死性有关。
宫颈鳞形细胞原位癌及早期浸润
除以上几项外再加IV型胶原蛋白、层粘蛋白
卵巢浆液性腺癌
CA125、 EMA 、CEA、P53、 Ki－67、 MRP3、 Pg糖蛋白
卵巢粘液性腺癌
CK7、CK20、CEA、EMA、CA125 、S-100、P53、Ki-67、MRP3、Pg糖蛋白
卵巢卵泡膜细胞瘤
Vimentin(+)( 但无法与纤维瘤区别) 因瘤细胞浆内含类脂质，用脂肪染色可证实
乳腺浸润性癌
ER、PR、SMA、P63、E-ca、P53、Ki-67、C-erbB-2、MRP3、Pg-糖蛋白
恶黑
S-100，HMB-45，NSE
免疫组化染色是通过一系列环节及过程。包括组织的固定，脱水，包埋，切片，各种抗体合理的稀释度，孵育时间及温度，各种有关溶液的浓度和PH值等等，使抗体抗原更好保存并有效地结合，再通过显色液显现出来，最后用苏木素衬染，每一步骤和环节都必须认真处理，一步差错全部失败。
常用的方法有S-P法、PAP法，ABC法。目前常用的是S-P法，即链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物法。此法可产生低背景，高放大效果，更加简便敏感和特异。
在完成免疫酶标记全过程后，对于如何判断标记的结果作出正确的诊断是非常重要的。
首先需要对本病例的石蜡切片，HE染色的切片有一个诊断意见，再次须掌握切片的主要病变区和细胞形态的特点，因为它是免疫组化标记的“靶细胞”，应根据“靶细胞”标记结果判断其性质。
在染色过程中，某些组织和细胞，如：红细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，中性粒细胞和退化变性坏死组织也可以出现非特异反应，影响对标记结果的判断。在镜下必须会识别，防止误认为阳性细胞。
抗原抗体结合后显色，阳性时呈棕色颗粒状。细胞阳性着色可以在细胞浆、细胞膜和细胞核。上皮性，肌源性，神经内分泌，黑色素，内皮细胞和外周神经细胞皆为细胞浆表达。即在细胞浆内出现棕色颗粒。淋巴细胞阳性表达是在细胞膜上，围绕细胞膜出现棕色线状结构。ER，PR阳性表达是棕色颗粒在细胞核内。
免疫组化检测对所有肿瘤的病理诊断和科研方面带来了很大的进步，解决了过去无法解决的问题。但是任何诊断方法都不是十全十美的，都有它的局限性。用单一的免疫组化还无法肯定肿瘤的良恶性。如：HMB-45恶黑是阳性表达，但良性黑色素瘤也是阳性表达。免疫组化不能独立作出判断和诊断，要和其他辅助方法与临床资料综合分析才能得出合理的解释。还不能离开传统的，基本的福尔马林固定，石蜡切片，HE染色的诊断方法，众所公认它仍是最经济，完善，快速的基本病理诊断技术。所以我们应该在做好HE 的基础上开展免疫组化工作。它只是一种辅助方法，扩大了诊断领域。
免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色
免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结 1 、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2 、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3 、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。
动物病理组织免疫组化制片操作规程 1、取材选材部位以病灶与正常组织交界处的组织标本为好，取材要完整，要尽可能注意到整个器官的结构特点。大小一般是1cm×1 cm×0.5 cm为宜。 在夹取组织时不要用力压、挤、揉等以免损坏组织。 2、固定以10%中性福尔马林固定液（固定液的量应为组织块的10-20倍）固定时间24-36小时。组织长时间固定，固定液中的福尔马林含有的杂质会产生一种酸，影响核的染色，整个组织显得非常陈旧。 3、全自动脱水机：包括脱水、透明、浸蜡等步骤 3.1、脱水组织经固定后，内含大量水分，须除尽水分才利于透明、浸蜡。常用酒精为脱水剂，逐级提高酒精浓度，以防组织过度收缩、变脆或脱水不完全而影响制片效果。脱水一般在室温下进行，由60%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精I、100%酒精II组成。组织块在酒精中时间不宜过长，否则组织块容易变硬。 如切片后的蜡块中央呈灰白粗糙而不透亮，放置一段时间后蜡块中央出现一陷窝，此即表明组织脱水不够彻底，组织面暴露后水分蒸发，蜡块中央收缩形成陷窝，严重时难以切出完整切片。注意定时更换新的脱水剂，一般在使用到1500个脱水盒(含组织块)后即可考虑更换脱水液。 3.2、透明在室温下，组织块采用二甲苯或TO透明剂中进行透明。一般透明剂分为I、II两个试剂缸。组织在二甲苯或TO透明剂中贮留时间必须严格掌握，时间稍长，则组织脆硬易碎；时间过短，石蜡不易渗透进去，使浸蜡不完全。3.3、浸蜡恒温杯内温度应调至58-60℃为宜，使石蜡熔化完全。石蜡分为I、II两个缸。尽量控制组织块在石蜡中的浸泡时间，时间过长组织易碎；时间过短，石蜡未渗透进去，组织不能切片。
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法 1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。 2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置} 目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境 <以下步骤是为细胞染色做准备> 3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}； 4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。枸橼酸修复液只能用一次。修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。 5）到时间后，把高压锅放入水池中用凉水冲至气体放出完，旋下锅盖，自然冷却至室温，大于30min。 6）冷却后取出切片架用凉清水冲洗3次，放入3% H2O2 罐中10min，目的：封闭过氧化物酶。【每天用前新放入10ml H2O2 】【配制方法：1000ml 3%的过氧化氢=100ml 30%过氧化氢+900ml蒸馏水，（H2O2保存需避光）】 7）捞出后用凉清水冲洗多次，应注意H2O2 有腐蚀性，最后一次用PBS（磷酸盐缓冲液），PBS
免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程 一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。 二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS（pH 7.34 ）：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml ； 1000 ml 0.2M PB （pH 7.4）＝5.93 g NaH 2 PO 4 2·H 2 O ＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B （A. 0.2 M NaH 2 PO 4 2·H 2 O ：15.6 g in 500 ml ddH 2 O ； B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O ：71.632 g in 1000 ml dH 2 O ）。 2. Citrate Buffered Saline （0.01 M 柠檬酸缓冲液， PH6.0 ）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O （A.Citrate acid
（柠檬酸）：10.5 g
加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium （柠檬酸钠）： 29.41 g 加 双蒸水至 1000 ml ）。 3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3% 双氧水和 0.5%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS ，再接着 加 120 ul TritonX-100, 并加热一儿，冷却至临用前加 0.4 ml 30 ％ H 2 O 2 。 4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。 5. 含 0.03 ％ H 2 O 2 的 0.05 ％DAB （避光） ：用 20×DAB （1％， 10 mg/ml ）5 ul ＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS 。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene 、梯度 Ethanol （100 ％×2、95％、80％、70％、50％）、 双蒸水、中性树胶（封裱剂）。 8. 苏木精染液： 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 60 ℃× 20 min →Xylene 2 × 10 minut ；es 80% ethanol 2 minutes ； 70% ethanol 2 minutes ； distilled water:5 min ； PBS 洗 3 次×3 min 。 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 100% absolute ethanol ：2 ×5 minutes ； 95% ethanol 2 minutes ；
免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体的保存： 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。 组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。 一、动物的致死法及取材 (一)致死法 (1)空气栓塞法向动物静脉注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。 (2)麻醉法可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。 (3)断头法用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。 (4)去头法用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。 (5)股动脉放血法动物麻醉后，切开股动脉放血致死。 (二)取材注意事项 (1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。 (2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿用力过重，以免挤压损伤组织。 二、尸体解剖的取材 尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。 (1)心和大血管右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。 (2)肺右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。 (3)肝右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。 (3)脾一块。 (4)胰一块。 (6)肾两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长 (7)膀胱一块。 (8)肾上腺左、右各取一块。 (9)消化道食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。 (10)骨脊椎骨一块。 (11)胸腺一块。 (12)子宫宫颈和宫体数块。 (13)睾丸或卵巢各一块。 (14)脑左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。 (15)脑下垂体一块，前叶或包括前后叶。 如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。 三、活检标本的取材 (一)常规活检标本的取材 应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪
一、泌尿与男性生殖系统肿瘤 前列腺癌：CK、P63、34E12、PSA、P504S（9AMAC）、AR 前列腺增生／腺瘤：CK、P63、34BE12、P504S 肾癌：CK、EMA、Inhibin、Melan－A、CK7、Vimentin、PAX2、CD10 肾母细胞瘤：WT－1、CK、P53、Ki－67 膀胱尿路上皮癌：CK7、CK20、P53、Ki－67、P63 精原细胞瘤：CK、PLAP、CD117、LCA、OCT3／4 二、淋巴造血系统肿瘤 胸腺肿瘤：CK、CD3、CD5、CD20、TdT、EBV＊ 霍奇金淋巴瘤：CD30、CD15、ALK－1、EMA、CD3、CD20、EBV＊、PAX －5 非霍奇金淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、TdT、CD43 间变大细胞淋巴瘤：CD30、CD15、ALK－1、EMA、CD3、CD20、EBV＊ 弥漫性大B细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD43、CD30、Ki－67 小B细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD10、CD20、CD23、CD79α、CyclinD1、TdT T细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD43、CD45RO、CD79α、TdT、TiA－1、Perforin 套细胞淋巴瘤：CD3、CD5、CD20、CD79α、CyclinD1、TdT、Bcl－2、Ki－67 T／NK细胞淋巴瘤：CD3、CD20、CD45RO、CD79α、CD56、TiA－1、Perforin、粒酶B 淋巴上皮病变／癌：CK、EMA、S－100、Ki－67、P53、EBV＊、P63、CD30、CD20
细胞免疫组化步骤 1. PBS冲洗两次 2. 丙酮固定10min 3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min 4. PBS振洗2次,每次3min 5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min 6. 弃去血清 7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释) 8. PBS振洗3次,每次3min 9. 加二抗, 37℃30 min 10. PBS振洗3次,每次3min 11. 加ABC复合剂, 37℃30 min 12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min 13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min 14. 自来水洗5min 15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精， 自来水洗，过氨水，自来水洗 16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min 17. 透明，过二甲苯3次，每次1min 18. 封片将有细胞的一面向下封片 一、免疫组化操作规程 （一）、仪器设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl 配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟；
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用 生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。 在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧 化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行 显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相 似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤， 同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免 疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1. 标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位， 可避免单克隆抗体图2. SP 法原理示意图
免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置 问题：免疫组化中的阳性对照与阴性对照如何设置？ 参考见解1：阳性对照：已知含有要测的抗原的组织。 阴性对照：可以做几种：空白对照：免去一抗 代替对照：免疫前血清代替一抗 已知阴性组织 抑制试验：未标记抗体 要发文章建议做代替对照。 参考见解2： 楼上回答的真好，不过组织内对照的合理使用可以免去设置实验对照的很多麻烦！ 问题：免疫组化技术(IHC)的优点是什么 参考见解： 1．特异性强免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。 2．敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。 3．定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。 免疫组化常见问题的处理 参考意见： 当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。 对照/标本无染色 ①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 ②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。 ③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
免疫组化常见问题与回答集锦 一、石蜡切片和冰冻切片的比较？ 1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。 3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在 -80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到 4 μm 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。 二、一抗的选择要点和技巧是什么？ 1.单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 2.应用范围的选择。有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。 3.种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。 4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。 5.生产厂家的选择。如 santa Cruz 公司抗体一般 1 ml，价格 2100 元左右； 而 chemicon 公司一抗一般 100 μl，价格 2800 元左右。这两个厂家的同一种抗体，它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做 WB 效果还可以。