实验室各种试剂的说明
1、二氨基联苯胺
二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底
物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学
(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。
保存条件
试剂盒应在-20℃，避光、密封保存。
使用说明
使用前先用蒸馏水将B显色液（1:25）稀释为工作液，然后按比例（1:25）加入A显色液，混匀后立即使用。显色时间1-30分钟，显色时间过长可引起本底增高，故应密切观察显色过程（一般3-10分钟最理想），并在本底较浅且达到适当显色强度时以流水漂洗终止显色反应。
稀释方法：取去离子水920ul,加入B显色液40ul混匀，再加入40ul的A显色液，混匀后即可使用。工作液建议用量：免疫组化50-100ul/切片，WB每张膜200－5000ul/膜
注意事项
1．DAB溶液应低温密封保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用；
2．显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用；
3．DAB在常温下不稳定，每次取用后均应及时加盖密封放回冰箱，以免因DAB分解影响实验，或因渗漏造成实验环境污染；
4．DAB有潜在致突变作用，操作时应注意穿戴好防护用具。
031*-2./4,+ 5 8679giaifi [`eg]\_debe^h \ZgZbe^ edb`d]:mwwtYOOyyyNwioiuiNjsqNjr .1/{30,z +|2}-4*~ Q c gunvM_\p Jt_WNTL WNVL XNPK : I JRNS7GDO :H :8b~:;:8:M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99 POg /} T8Yclw\1yU <8[?`~t 3-C9ix ;AD gQG O U =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y H 体外诊断试剂设计开发与注册申报 工作程序 目录 一、策划阶段 (1) 1.主要工作内容 (1) 2.设计开发文件 (1) 3.其他文件 (1) 二、输入阶段 (1) 1.主要工作内容 (1) 2.设计开发文件 (2) 三、小试阶段 (2) 1.主要工作内容 (2) 2.注册申报资料 (3) 3.设计开发文件 (4) 4.其他文件 (4) 四、中试阶段 (4) 1.主要工作内容 (4) 2.注册申报资料 (8) 3.设计开发文件 (9) 4.其他文件 (9) 五、输出 (9) 六、试产阶段 (9) 1.主要工作内容 (9) 2.注册申报资料 (10) 3.设计开发文件 (10) 4.其他文件 (10) 七、注册检测 (10) 1.主要工作内容 (10) 2.注册申报资料 (11) 3.设计开发文件 (11) 4.其他文件 (11) 八、设计更改变更 (11) 九、临床试验 (12) 1.主要工作内容 (12) 2.注册申报资料 (13) 3.设计开发文件 (13) 4.其他文件 (13) 十、注册申报 (14) 1.主要工作内容 (14) 2.注册申报资料 (14) 3.设计开发文件 (16) 4.其他文件 (16) 本工作程序主要明确研发部在新产品设计开发和注册申报过程中，应熟悉 和掌握的流程、需提供的资料。 体外诊断试剂注册申报流程如下： 一、策划阶段 1.主要工作内容 项目立项及评审。 2.设计开发文件 2.1立项 研发人员根据项目建议进行市场调研，提出立项依据，产品性能要求、实施方案、项目进度安排、资源及需求、相关文献及法规。立项书模板见《体外诊断试剂设计开发记录模板——立项书》 2.2策划阶段的评审 研发部经理组织相关人员和部门进行策划评审。 主要考察项目立项调研、可行性分析和必要性分析等立项依据是否详实可靠，拟定的产品性能要求是否合乎临床实际需求，初步拟定的产品方案是否可执行、项目进度安排、时间和财务预算是否合理，所参考的文献和相关法规是否合适等。 模板见《体外诊断试剂设计开发记录模板——设计开发评审报告-策划阶段》。 3.其他文件 记录操作规程 二、输入阶段 1.主要工作内容 明确项目任务、制定详细的计划书、风险分析评估并编制风险管理报告，形 人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可 体外诊断试剂注册检验送检须知 2017年12月27日发布 一、体外诊断试剂注册检验适用范围 凡依据《体外诊断试剂注册管理办法》及其相关文件规定，向我院提出检验申请的，属体外诊断试剂注册检验。包括样品检验和质量标准复核。 二、体外诊断试剂注册检验的分类 体外诊断试剂注册检验主要包括国产首次注册、进口首次注册、注册变更、延续注册。 三、申请体外诊断试剂注册检验应填写的表格 申请体外诊断试剂注册检验，应填写“检验申请表”，并报送相关资料及样品。 四、申请体外诊断试剂注册检验应提交的资料 体外诊断试剂注册检验资料分以下四类： （一）国产体外诊断试剂首次申请注册检验需提供的资料: 1.申请单位出具的检验申请函，加盖申请单位公章；检验申请表(请登记联系人电话和E-mail信息)； 2.证明文件：申请人企业许可证（复印件）,提交资料真实性的声明。 3.抽样单（抽样凭证及记录），加盖抽样单位公章； 4.综述资料； 5.产品说明书； 6.拟定申报产品技术要求； 7.主要原材料研究资料； 8.分析性能评估资料； 9.参考值（范围）确定资料； 10.稳定性研究资料； 11.标准品（参照品）及资料（包括企业提供的标准品的溯源性、制备过程、浓度及测定方法、批次、效期、使用说明、储存条件信息；另外，检验中如有需要，申报单位应在接到通知后10个工作日内提供均匀性和不确定度的相关数据资料）； 12.自检报告； 13.工艺及反应体系研究资料（送检时可暂不提供，检验中如有需要，应在接到通知后10个工作日内提供）； 14.生产记录（送检时可暂不提供，检验中如有需要，应在接到通知后10个工作日内提供）。 以上资料均需加盖申请单位公章。 （二）进口体外诊断试剂首次申请注册检验需提供的资料: 1.申请单位出具的检验申请函，加盖申请单位公章；检验申请表(请登记联系人电话和E-mail信息)； 2.指定代理人的委托书，代理人的机构证明复印件；所提交资料真实性的声明; 3.综述资料,原文及译文； 4.产品说明书； 5.拟定申报产品技术要求； 6.主要原材料研究资料,原文及译文； 7.分析性能评估资料,原文及译文； 8.参考值（范围）确定资料,原文及译文； 9.稳定性研究资料,原文及译文； 10.标准品（参照品）及资料（包括企业提供的标准品的溯源性、制备过程、浓度及测 附件1 中华人民共和国 医疗器械注册证（体外诊断试剂） （格式） 注册证编号: 日 有效期至：年月日 附件2 中华人民共和国 医疗器械注册变更文件（体外诊断试剂） （格式） 注册证编号: 附件3 体外诊断试剂注册申报资料要求及说明 注：申请人应当根据产品类别按照上表要求提交申报资料。 V :必须提供的资料。 △:注册申请时不需要提供，由申报单位保存，如技术审评需要时提供。 一、申请表 二、证明性文件 （一）境内申请人应当提交：企业营业执照副本复印件和组织机构代码证复印件。 （二）境外申请人应提交 1. 申请人注册地或者生产地址所在国家（地区）医疗器械主管部门出具的允许产品上市销售的证明文件和可以合法生产申报产品的资格证明文件，如该证明文件中有产品类别描述，其类别应当覆盖申报产品。 2. 申请人注册地或者生产地址所在国家（地区）未将该产品作为医疗器械管理的，申请人需要提供相关证明文件，包括注册地或者生产地址所在国家（地区）准许该产品上市销售的证明文件。 3. 申请人符合注册地或者生产地址所在国家（地区）医疗器械质量管理体系要求或者通过其他质量管理体系认证的证明文件。 4. 申请人在中国境内指定代理人的委托书、代理人承诺书及营业执照副本复印件或者机构登记证明副本复印件。 三、综述资料 （一）产品预期用途。描述产品的预期用途，与预期用途相关的临床适应症背景情况，如临床适应症的发生率、易感人群等，相关的临床或实验室诊断方法等。 （二）产品描述。描述产品所采用的技术原理，主要原材料的来源及制备方法，主要生产工艺过程，质控品、校准品的制备方法及溯源（定值）情况。 （三）有关生物安全性方面说明。由于体外诊断试剂中的主要原材料可能是由各种动物、病原体、人源的组织和体液等生物材料经处理或者添加某些物质制备而成，人源性材料须对有关传染病 （HIV、HBV HCV等）病原体检测予以说明，并提供相关的证明文件。其他动物源及微生物来源的材料，应当提供相应的说明文件，证明其在产品运 输、使用过程中对使用者和环境是安全的，并对上 述原材料所采用的灭活等试验方法予以说明 （四）有关产品主要研究结果的总结和评价。 B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中 大量全血基因组DNA提取试剂盒 目录号：DN04 DN0401 16次×10ml DN0402 32次×10ml DN0403 96次×10ml 适用范围： 适用于快速提取各种动物全血基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存16次×10ml 32次×10ml 96次×10ml 10x红细胞裂解液室温50 ml 100 ml 300 ml 细胞核裂解液室温180 ml 180×2 ml 250 m l×4 蛋白沉淀液室温55 ml 110 ml 330 ml DNA溶解液室温15 ml 30 ml 90 ml 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒根据全血特点采用几个快速步骤提取基因组DNA。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA 溶解液。 产品特点： 1.从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在1小时内完成。 4.结果稳定，产量高（典型的产量10ml全血可提取出150-500μg），OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9，长度可达50kb-150kb，可直接用于构建文库、PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 注意事项 1.所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到2,500 x g，并配备容纳50ml心 管转头的传统台式离心机。 2.用户需自备异丙醇和70％乙醇。 3.典型的产量10ml全血可提取出150-500μg基因组DNA（不同样品尤其疾病样品中 中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大）。 4.本试剂盒为溶液型，可以很容易的按照比例扩大或者缩小每次处理的全血量 （20μl-10ml），请联系我们索取其它处理量的操作手册。 Code No.：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100次量） 目录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A9 ●参考文献 9 ●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1- 一类体外诊断试剂重新注册申请表 申请事项 1注册分类：○一类 2有效期届满重新注册○与原注册批准内容无任何变化 3合并变更申请事项：○登记事项变更： ○变更生产企业名称 ○变更生产企业注册地址 ○变更产品名称、商品名、英文名 ○变更生产地址（文字性变更） ○变更注册产品标准（文字性变更） ○变更产品说明书（文字性变更） ○许可事项变更： ○变更生产过程中所用抗原、抗体等主要材料 ○变更检测条件及参考值（或参考范围）等 ○变更注册产品标准中所设定的项目、指标、试验方法等 ○变更产品说明书中的内容，如变更或增加包装规格、增加适用机型等 ○变更产品储存条件和/或产品有效期 ○增加临床适用范围，如增加临床适应症、增加临床测定用样本类型等 ○变更生产地址（生产场所的实质性变更） ○其他可能影响产品安全性、有效性的变更 ○其他： 产品情况 3.产品名称： 4英文名称： 5.商品名称： 6.其他名称： 7.包装规格： 8.主要组成成份： 9.预期用途： 10.产品有效期： 11.方法原理： 相关情况 12.注册证号：批准日期：终止日期： 注册产品标准： 13.申报过的变更申请情况： ○登记事项变更○许可事项变更○其他 批件批准日期：批件批准日期： 变更内容 变更申请的内容： 原批准注册的相应内容： 变更申请理由： 申请人 14.名称： 15.《医疗器械生产许可证》编号： 16.注册地址：邮政编码： 17.生产地址：邮政编码： 18.联系人：职位： 办公电话及手机：传真： 电子信箱： 19.法定代表人： 申明 20.我们保证：①本申请遵守《医疗器械监督管理条例》和《体外诊断试剂注册管理办法》等法律、法规和规章的规定；②申请表内容及所提交资料均真实、来源合法，未侵犯他人的权益，其中试验研究的方法和数据均为本产品所采用的方法和由本产品得到的试验数据。 如查有不实之处，我们承担由此导致的一切法律后果。 21.其他特别申明事项： 22.申请机构名称、公章、法定代表人签名、签名日期： 法定代表人签名： （申请单位盖章）日期：年月日 审查意见： 经办人：审核人： 年月日年月日 审批意见： 签字： 年月日 人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长 组织基因组DNA提取试剂盒（磁珠法） 使用说明书（Cat#Yu-TD02-1） 【产品介绍】 组织基因组DNA提取试剂采用国内领先的专利技术合成的纳米磁珠颗粒和多次实验优化的缓冲液体系，能从样品中分离纯化高质量DNA。在一定条件下，磁珠表面修饰的基团高效吸附目的DNA，而当条件改变时，磁珠释放吸附的DNA，达到快速分离纯化DNA的目的。整个过程安全、无毒、便利，提取的DNA质量稳定、纯度高。纯化后的DNA适用于多种后续实验。本试剂盒可以从少量动物组织中分离纯化出高质量、高浓度的DNA。 【产品特点】 1. 效率高：DNA提取得率高，操作简便。 2. 安全、无毒害：整个操作过程无需使用苯酚、氯仿等有毒物质，提取环境更加安全。 3. 高纯度：OD260/230在1.5左右，OD260/280在2.0左右。可直接用于各种分子生物学实验。 【试剂盒组成】 【规格】50T/盒 【自备试剂】无水乙醇，异丙醇 【贮藏与有效期】 裂解吸附液和Buffer AW1必须室温（15-25℃）避光保存；磁珠室温保存；其他所有试剂室温保存，有效期为1年。 【注意事项】 1、Buffer AW1使用前，加入18mL无水乙醇，混匀，使乙醇含量为60%。★ 2、Buffer AW2使用前，加入21mL无水乙醇，混匀，使乙醇含量为70%。★ 3、磁珠使用前必须充分混匀。★ 4、组织最好置于组织核酸（DNA/RNA）保存液（Cat#Yu-TP01）或液氮中保存。【操作步骤】 1、样本的处理 1.1、液氮中保存的组织将组织在液氮中磨成粉末后，使液氮充分挥发。再以50-100mg组织中加入1mL裂解吸附液，充分研磨。以下进入步骤2。 1.2、组织保存液中保存的样本取出在组织保存液中保存的组织，加入1mL无水乙醇洗涤组织两次。再以50-100mg组织中加入1mL裂解吸附液，充分研磨。以下进入步骤2。 2、吸取400μL研磨后的裂解吸附液转入1.5mL的EP管中，加入5μL蛋白酶K，60℃1500rpm10分钟。 3、取出EP管，加入250μL异丙醇和10μL混匀的磁珠，闭盖，充分混匀。室温1500rpm振荡10min。 4、取出EP管，瞬时离心，将EP管放于磁力架上，吸附磁珠4分钟。 5、在磁力架上，打开EP管盖，吸弃液体，保留磁珠。 6、加入600μL Buffer AW1，闭盖。从磁力架上取下EP管，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。 注：可以在漩涡振荡仪上3000rpm振荡20秒，使EP管壁上的磁珠完全分散至洗液中。 7、将EP管放回磁力架，吸附磁珠3分钟至液体清澈（吸附磁珠2分钟后，颠倒磁力架3次，使EP管盖上残留的磁珠被充分回收）。打开EP管盖子，吸弃液体，保留磁珠（需吸干EP管底和管盖中的残留液体）。 注：由于各个实验室磁力架磁力不尽相同，吸附时间可以延长，直至液体清澈。 8、加入600μL Buffer AW2，闭盖。从磁力架上取下EP管，充分混匀使磁珠完全分散至洗液中。 注：可以在漩涡振荡仪上3000rpm振荡20秒，使EP管壁上的磁珠完全分散至洗液中。 Code No. RR047A 研究用 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书 目录 内容页码 ●制品说明1 ●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8 ●制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。注意：Takara Bio使用SYBR? Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。SYBR?为Molecular Probes Inc.的注册商标。 ●制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1：5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2：含有RNase Inhibitor。 *3：含有dNTP Mixture。 *4：含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。 注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ●试剂盒外必备材料 热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块） 反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ●保存：-20℃。 人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 7测试/盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1 DNAzol 基因组DNA快速提取试剂 目录号：DN26 DN2601 50ml DN2602 100ml 产品介绍： DNAzol 是一种完全的、可直接使用的基因组DNA提取试剂，简单高效，结果可靠，可快速提取基因组DNA，适用于多种大量或少量样品。DNAzol 可在一个步骤中裂解细胞并水解RNA，经过乙醇沉淀后即可快速得到基因组DNA。整个过程只需10-30 分钟，DNA 回收率可达70-100％，得到的DNA 不需再纯化，可直接用于Southern 杂交、斑点杂交、分子克隆、PCR 反应和其他分子生物学应用。 产品储存： 室温保存至少一年。 注意事项： DNAzol 有毒害性，应避免直接接触皮肤和眼睛。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 1.裂解，匀浆 a.组织：25-50mg 组织加1ml DNAzol ，使用匀浆仪处理5-10 次。少量 （5-10mg）柔软组织，如脾或脑组织，可切成或者捣成小块使用微量取样器吹打 混匀，室温放置5-10 分钟。 b.细胞：单层培养的细胞应直接裂解，倒出培养基，加入DNAzol 用取样器吹 打几次混匀。每10cm2 细胞培养板加0.75-1.0ml DNAzol。 c.细胞沉淀或悬浮液：每1-3×107细胞（体积小于0.1ml）加1ml DNAzol，反复 吹打混匀。 以上均要使用大口径枪头吹打，以免过度剪切断基因组。 2.离心 4 -25℃，10000g 离心10 分钟。将得到的上清转入新管。 此步骤去除组织碎片、部分水解的RNA和多糖。如果所提样品为含较多细胞和细胞外物质的样品，如肝、肌肉和大部分植物组织等，或要提取不含RNA 的DNA 时，可加此步骤。其他样品可省略此步。 3.沉淀 每使用1ml DNAzol 加0.5ml 100%乙醇，颠倒离心管5-8 次，混匀样品至出现DNA 沉淀，室温放置1-3分钟。可以看见DNA 絮状沉淀，让沉淀自然沉降到管底，尽可能吸弃上清。用枪头搅绕DNA贴附在离心管上端壁上，仔细吸弃剩下的在管底和管壁的上清。如果因为剪切太厉害导致形成小片段或者量少的DNA(少于15ug)，无法缠绕到枪头上，可在4 -25℃，4000g 离心1-2分钟沉淀DNA，弃上清。 4.漂洗 用0.8-1ml 75％乙醇漂洗DNA 两次。漂洗时，将DNA 悬浮在乙醇中，颠倒离心管3-6 次，然后静置0.5-1 分钟使DNA 沉降到管底，尽可能吸弃上清。 如果需要，可在4 -25℃，1000g 离心1-2 分钟沉淀DNA。从组织中提取DNA 时，如需去除其他内含物，第一次漂洗可用70％DNAzol 和30％乙醇的溶液代替75％乙醇。 通用基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号：D2100 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。开封后请将RNase A，蛋白酶K于-20℃保存。 试剂盒内容：D2100-50T D2100-100T RNase A1ml1ml×2 蛋白酶K1ml1ml×2 溶液A25ml50ml 溶液B25ml50ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液15ml30ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 产品简介: 本试剂盒为通用型，适合于从土壤，粪便，昆虫，以及其他样本中提取基因组DNA。对细菌，真菌，昆虫等样本都具有很好的裂解效果，最大限度的保留了生物DNA的多态性。 使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、样品的处理： 1）土壤：称取0.1-0.3g(根据干湿)土壤，放入研钵中，倒入适量的液氮，立即研磨，重复3次，使土壤颗粒研成粉末，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 2）粪便：称取0.1-0.3g(根据干湿)粪便，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 3）昆虫：称取0.1-0.3g昆虫，倒入适量的液氮，立即研磨，重复3次，使昆虫研成粉末，加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 4）未知样品，如为细未状，可直接称取0.1-0.3g(根据干湿)加500ul 溶液A，如为块状，可0.1-0.3g用液氮研磨成粉未，再加500ul溶液A，振荡至彻底悬浮。 2、向悬浮液中加入20ul10mg/ml的RNase A，55℃放置10min。 3、加入20ul10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000转离心10min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。 4、加入500ul溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，于55℃放置5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，请增加消化时间。 体外诊断试剂注册检验抽样服务指南 一、适用范围 本指南适用于本市各区县市场监督管理局为辖区内体外诊断试剂生产企业的第二、三类体外诊断试剂开展注册检验抽样。 二、服务依据： 1、国务院令第650号《医疗器械监督管理条例》 2、国家食品药品监督管理总局令第5号《体外诊断试剂注册管理办法》 3、关于实施《医疗器械注册管理办法》和《体外诊断试剂注册管理办法》有关事项的通知（食药监械管〔2014〕 144号） 三、承办部门 上海市各区县市场监督管理局（办理地点、工作时间、联系电话以各区县市场监督管理局公布为准） 四、抽样流程 1、请企业向生产地所属区县市场监督管理局提出第二、三类体外诊断试剂注册检验抽样的需求。 2、请企业在“表格下载”页面中下载“附件1、体外诊断试剂注册检验抽样申请表”，以及“附件2、体 外诊断试剂注册检验抽样单”，分别按表格下方的注意事项填写完成并打印（附件1一份，附件2一式三份），均加盖企业公章。 3、请企业将已盖章的上述资料纸质文档递交至上海市各区县市场监督管理局业务受理部门（办理地点、工 作时间、联系电话以各区县市场监督管理局公布为准）。 4、各区县市场监督管理局自接收资料之后15个工作日内通知企业抽样时间。 5、申请抽样的体外诊断试剂样品必须是企业自行生产的（根据5号令第十条，按照创新医疗器械特别审批 程序审批的境内体外诊断试剂除外，其样品可以委托其他具有相应生产范围的医疗器械生产企业生产。 是否属于创新产品由国家总局创新医疗器械审查办公室最终审查决定）。 6、请企业准备以下资料，在抽样时出示给各区县市场监督管理局派出的抽样人员，其中真实性承诺书需要 交予抽样人员归档： 1）真实性承诺书，承诺企业已按照相应的产品技术要求和医疗器械质量管理体系的相关要求自行生产送检样品，并按照相应的产品技术要求完成了拟送检样品的全性能自测报告；承诺企业留存生产样品 的主要原材料采购记录（采购发票、供方质保书、采购证明等）、样品的生产记录备查。 2）拟送检样品全性能自测报告。 7、抽样人员需根据企业递交的“附件1、体外诊断试剂注册检验抽样申请表”、“附件2、体外诊断试剂 注册检验抽样单”，核对相关信息后开展抽样工作。 1.加2g土壤到15mL Bead Tube中 2.加入0.25mLSR1和0.8mLSR2之后，加入2.5mL Bead Solution到Bead Tube 3.加入3.5mL酚：氯仿：异戊醇25:24:1到试管中，加盖后涡旋混合直到分层消失。 4.最大转速涡旋震荡15min 5.室温，2500g离心10min 6.取出后，小心地转移上层水相到干净的15mL收集管中，弃掉下层酚 7.加1.5mL SR3到水相中，然后涡旋混匀，4℃孵育10min 8.室温，2500g离心10min。转移上清到一个新的15mL收集管中 9.加入5mL SR4溶液到装有上清的收集管中，混匀，室温孵育30min 10.室温，2500g离心30min 11.倒掉上清，将收集管倒置在纸上5min 12.震荡SR5混合。加1mL SR5到15mL收集管中，并反复吹打使完全重悬。 13.为每一个RNA样品准备一个RNA Capture Column A．拿去15mL收集管的盖子，将RNA Capture Column放入15mL收集管中。 B．加2mL SR5到RNA Capture Column中，让其完全流尽。 14.从第12步加入RNA样品至RNA Capture Column中，然后让其在重力作用下流尽。收集 液体。 15.用1mLSR5清洗柱子。重力流尽，收集洗脱液。 16.转移柱子到新的收集管，加入SR6震荡混合，然后加入1mL SR6到RNA Capture Column 洗脱RNA到15mL收集管中，重力流尽。 17.转移洗脱的RNA到2.2mL收集管中，并且加入1mL SR4.颠倒至少一次混合，然后-20℃ 孵育最少10min 18.室温13000g离心15min浓缩RNA 19.倒掉上清并倒转收集管在纸上10min晾干 20.用100μL SR7溶液重悬RNA沉淀，去除其中的基因组体外诊断试剂设计开发与注册申报工作程序
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