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胎儿染色体非整倍体（ T21、 T18、 T13）
检测试剂盒（高通量测序法）注册技术审查指
导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体
（T21、T18 、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料
的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审
评提供参考。
本指导原则是针对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的
具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相
应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行
充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注
册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满
足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，
并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相
关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下
制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，
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本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、范围
胎儿染色体非整倍体（Fetal Chromosome Aneuploidies ）中
的21 三体、 18 三体、 13 三体（ Trisomies 21、 Trisomies 18、Trisomies13 ，即 T21 、T18、T13）是临床上最常见的染色体非整
倍体疾病。其对应的分别为 21-三体综合征（又称唐氏综合征，先天愚型
或 Down 综合征）、18-三体综合征（又称 Edwards 综合征）和 13-三体
综合征（又称 Patau 综合征），发病率分别约为 1/700、1/6000、1/10000，患儿绝大多数存在严重智力障碍及器官畸形。
产前筛查和产前诊断是为避免产生遗传缺陷患儿提供的手
段。常规的产前筛查方法包括：早孕期的超声与血清学联合筛查和中
孕期母体血清学筛查。筛查结果为高风险的孕妇经建议经产前诊断进
行最终确认，由孕妇知情选择。胎儿染色体异常的产前诊断金标准
为介入前产前诊断手术 ,是指通过绒毛取材术 /羊膜腔穿刺术 /经皮脐
血管穿刺术，取相应细胞采用细胞生物学方法对
胎儿染色体进行核型分析。
高通量测序方法检测胎儿染色体非整倍体的原理是：孕妇母体
血浆中存在胎儿游离DNA （cell-free DNA ，cfDNA ），长度约为
75bp— 250bp，几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞，其浓度和
孕周密切相关并以一定比例（ 5%— 30%）稳定存在于母体外周血
浆中。高通量测序方法通过取母体血浆提取包含正常母体和胎
—2——
儿的血浆游离DNA ，经文库构建，片段扩增等，最后进行上机
测序，通过软件分析数据获得染色体数目评价结果。以检测21三体综合征为例，当对怀有T21胎儿的母体血浆游离DNA 数据进行分析时，其 21 号染色体游离DNA 总数会有小比例的升高，
通过统计学算法区分这一微小差异来实现利用cfDNA进行胎儿染色体非整倍体的产前筛查。但高通量测序法不能对染色体结构
异常进行检测，不能代替传统筛查中的开放式神经管缺陷筛查等。
本指导原则所述的胎儿染色体非整倍体（T21 、 T18 、 T13 ）检测试剂盒（高通量测序法）是指通过高通量测序法检测孕妇外
周血血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸（DNA ），通过分析样本中的胎儿游离DNA 的 21 号、18 号及 13 号染色体数量的差异，预期用于对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、 18-三体综合征
和13-三体综合征进行产前筛查的检测试剂盒。
本指导原则所述的高通量测序法，是指通过文库构建、片段
扩增进而进行上机测序的第二代测序方法，不需要进行片段扩增
的第三代、第四代单分子测序方法在文中并未涉及。但高通量测
序技术发展迅速，第三代、第四代单分子测序方法在企业内部参
考品设臵、性能评估或临床评价等处如有适用的方面，可以参照执行。
本指导原则所述检测试剂盒的适用人群为：对孕周为12+0周及以上的孕妇进行产前筛查，其结果不能代表对孕妇怀有三体
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胎儿的确认，产前筛查的结果必须要经过产前诊断进行确认。
伦理学原则应遵守国家相关法律法规及行业规定。
二、注册申报资料要求
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他内容。
其中，其他内容包括同类产品在国内外批准上市的情况，应着重从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批
准的同类产品之间的主要区别。综述资料应符合《体外诊断试剂
注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第 5 号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批
准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告 2014 年第 44 号，以下简称“公告” ）的相关要求。
综述资料应详细阐明检测原理，可配合图示并写明一个完整检测配合使用的全部试剂及耗材名称、生产厂家、货号或注册证
书号以及详细的组成成分。
（二）主要原材料的研究资料
主要原材料的研究资料包括企业内部参考品和完成检测所
需试剂组成两部分。
1.企业内部参考品应至少包括：阳性参考品、阴性参考品、
检测限参考品、嵌合体参考品，具体要求如下：
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1.1 阳性参考品：应采用T21 、 T18、T13 胎儿 DNA 片段按一定比例与正常女性血浆混合的模拟样本。
1.2 阴性参考品：应包括采用染色体数目正常胎儿DNA 片段按一定比例与正常女性血浆混合的模拟样本，以及采用其他染色体异常胎儿DNA 片段按一定比例与正常女性血浆混合的模拟
样本。其他染色体异常的阴性参考品由申请人依据常见染色体异
常项目并根据对产品的质控要求自行选择。
1.3 检测限参考品：应采用T21 、 T18、 T13 胎儿 DNA 片段按不同比例梯度与正常女性血浆混合的模拟样本，如 5%、3.5%、
2.5%等，建议采用95%（n≥ 20）的阳性检出率作为最低检测限
确定的标准。
1.4 嵌合体参考品：由申请人按照对产品的质控要求自行设
定模拟 T21 、T18 和 T13 嵌合体的组成比例，如70%异常， 30%正常； 30%异常， 70%正常等。
T21 、T18、T13 及其他染色体异常胎儿DNA 片段可由流产组织或羊水细胞、细胞系等来源制备。
申请人应详细说明企业内部参考品的组成、详细说明制备及检定方法、胎儿 DNA 片段浓度确认方式和所占比例的选择依据。
组成各项企业内部参考品的样本应为不同来源。
2.完成全部检测流程所需试剂一般应至少包括：血浆游离
DNA 提取纯化试剂、文库构建试剂、文库定量试剂、测序试剂、
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阴性质控品、阳性质控品以及与之配合使用的测序芯片和数据分
析软件。具体要求如下：
2.1 血浆游离DNA 提取纯化试剂：无论申报产品中是否包
含，申请人均应提交配合使用的提取纯化试剂的原理、详细组成成分、生产厂家、货号及第一类医疗器械备案凭证编号的相关资料。
性能方面需对该试剂提取的 DNA 片段长度范围准确性及纯度要求，提取效率、重复性及抗干扰能力进行评估。
2.2 文库构建试剂、文库定量试剂、测序试剂：文库构建试
剂对片段化的 DNA 进行缺口补平及相应部分5’端磷酸化（如需）和3’端去磷酸化（如需），之后使用连接酶加上用于测序和分析
的标签和接头，构建成可以用来测序上机的标准文库；文库定量试剂通过 PCR 扩增及与标准品曲线的比对，用于定量测定文库
浓度，为后续均一化文库进行上机测序做准备，同时能够评估文库构建的质量。文库定量时应明确对文库质量、片段大小及浓度
要求，应提供分析图谱，对其中参数进行解释说明（如是否有杂
峰，产生的原因，是否对最终结果产生影响等）。文库定量不限于上述方法，也可采用其他方法进行，如荧光染料法、Qubit 定量等；测序试剂用于对均一化的文库进行片段扩增，通过基因测序仪捕捉扩增过程中碱基的变化引起的信号变化来达到读取序
列的目的。
以上三种试剂一般由：相应功能的酶（末端修复酶、DNA
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连接酶、缺口修复酶 DNA 聚合酶等）、核苷酸序列（引物、接头序列、标签序列、文库定量标准品）、缓冲液及 dNTP 组成。具体要
求如下：
2.2.1 酶：应提交纯度、活性及功能性试验资料。例如：文库构建过程包括但不限于末端修复酶、DNA连接酶、缺口修复聚
合酶等，所选择的酶应当具有末端突出削平、缺口补平、标签或接头连接、 DNA 聚合酶活性。
2.2.2 核苷酸序列：应提交相应的序列组成和纯度信息，序列准确度；引物设计应提交引物设计原则及选择对比依据。
2.2.3 缓冲液：应明确详细的组成及各盐浓度选择对比的依据。
2.2.4 dNTP ：包括 dATP、dGTP 、dCTP、dTTP ，应提交对纯度、浓度等的详细验证资料。
2.3 阴、阳性质控品：须能够监控DNA 片段提取到最终测序结果全过程，因此应当由阴、阳性（T21、 T18 和 T13 ）胎儿DNA 片段按已知比例与正常女性血浆基质混合组成。
2.4 测序芯片：应详细阐明芯片进行片段扩增的原理及结构，
明确使用芯片型号，并对同一次测序芯片上样的样本间精密度进
行评价。
2.5 数据分析软件：举例介绍原始数据质量评估、数据处理
和筛选的方法，明确数据筛选依据以及使用的算法。
2.6 提交不同原材料对于最终测序数据质量影响的评估材料。
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由于各测序平台的技术侧重点不同，数据质量评估的项目可能存
在差异，需考虑包括但不限于以下方面：文库浓度、文库片段大小、单样本总序列数（数据量）、唯一比对率、单次检测的GC gap （最高 GC 值与最低GC 值的差值）等。
2.7 除上述资料，申请人还应提交主要原材料的筛选依据及
试验资料。如为自制，则应提交：制备方法、质量要求、质量检
测方法、对比筛选的试验资料等；如为外购，则应提交：外购证
书、质量要求、质量检测方法、对比筛选的试验资料等。其中，
对比筛选的试验资料应包括筛选过程中的数据、图谱、对比图表等信息。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
1.主要生产工艺包括配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对关键参数进行有效控制。所提交申报资料中应包括主要生产工艺介绍和生产工艺流程图，后者需标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。
2.反应体系研究指完成检测所涉及到的最佳反应条件的选
择确定过程，包括对提取纯化步骤、游离 DNA 片段的末端修复、接头及标签连接、文库定量、片段扩增、测序反应的反应条件及反应
体系的选择确定，涉及到对样本类型、样本用量、试剂用量、缓冲体系的选择、反应温度和时间条件及检测过程中质控方法确
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定的依据。重点关注：酶浓度、引物浓度、dNTP 浓度、离子浓
度、加样量及反应体积、片段扩增各阶段温度、时间及循环数、测
序数据质量的评估指标等，其中加样量和反应体积应参考相应行
业标准，经研究验证后确定。
此外，还应对数据量及胎儿游离 DNA 浓度和比例对检测结果
的影响进行研究。
（四）分析性能评估资料
申请人应提交产品在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进
行的全部性能的评估资料，对于每项分析性能的评价都应包括研
究目的、实验设计、研究方法、可接受标准、实验数据、统计方
法等详细资料。有关分析性能评估的背景信息也应在申报资料中
有所体现，包括实验地点（实验室）、人员及数量、适用仪器、
试剂规格、批号、临床样本来源（如涉及）等。分析性能评估的
实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南
（CLSI-EP ）文件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原
则进行。建议着重对以下分析性能进行研究：
1.最低检出限：建议使用企业参考品进行梯度稀释并多次检
测，将具有95%阳性检出率的胎儿游离DNA 浓度水平作为最低
检出限。企业参考品应使用公认的准确定量方法进行，最低检出限应描述为XX DNA浓度下可检出胎儿DNA 的最小百分比。
2.企业内部参考品符合率：对试剂检测企业内部参考品的符
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合情况进行评估。
3.精密度：精密度的评价方法并无统一的标准可依，可根据
不同产品特征或企业的研究习惯进行，前提是必须保证研究的科
学合理性，具体实验方法可以参考相关的美国临床实验室标准化
协会批准指南（CLSI-EP ）或国内有关体外诊断产品性能评估的
指导原则进行。企业应对每项精密度指标的评价标准做出合理要
求，如标准差或变异系数的范围等。针对本类产品的精密度评价
主要包括以下要求：
3.1 对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除检测试剂（包括核酸分离 /纯化组分）本身的影响外，应对高通量基因测序
仪、操作者、地点、合理的精密度评价周期等要素进行相关的验
证。
例如：为期至少XX 天的连续检测，每天至少由 2 人完成不少于 2 次的完整检测，从而对批内/批间、日内 /日间以及不同操
作者之间的精密度进行综合评价。申请人还应选择不同的实验室
进行重复实验以对室间精密度进行评价。
3.2 用于精密度评价的模拟样品和临床样本均应至少包含3个水平：阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根
据产品特性设定适当的精密度要求。精密度评价中的每一次检测
均应从核酸提取开始。
4.干扰试验：包括内源性干扰物质和外源性干扰物质。应针
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对可能存在的干扰情况进行验证。建议申请人在干扰物质的潜在
最大浓度 (即“最差条件” )条件下进行评价。内源性干扰物质的评
价至少应包括胆红素、游离血红蛋白、甘油三酯。
5.特异性：对以下是否干扰 T21 、T18 、T13 阴阳性的检出能
力进行评价：
5.1 微缺失、微重复评价：申请人应采用一定比例的微缺失、
微重复胎儿 DNA 与正常女性血浆混合制备微缺失、微重复模拟
样本进行评价。
5.2 嵌合体评价：申请人应采用不同嵌合比例的模拟T21、T18 和 T13 嵌合体样本对试剂检测嵌合体的能力进行评估，对不能检测到的模拟嵌合体的嵌合比例进行确认。
5.3 对其他常见染色体样本的干扰进行评价。
微缺失微重复模拟样本、嵌合体模拟样本及其他常见染色体
样本的类型和数量由申请人选择确定，并在产品说明书中明确。
（五）阳性判断值的确定资料
由于目前胎儿染色体非整倍体 T13 、T18 、 T21 的阳性判断值
存在多种计算方式，且更好的算法和数据处理方式仍在不断开发中。因此，如申请人选择了某一算法作为阳性判断值的计算方
式，则应详细阐述选择该算法作为阳性判断值依据的原因（如权威文献、行业共识等），并详细阐述计算公式和各参数代表的意义。
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以大样本量常用的Z-值（ Z-score）算法来举例说明：
1.Z- 值这个统计量反应的是当前数值距离平均数的相对标
准距离， Z-值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布，计算公式如下：
1.1chrN z-score for test sample: 所检测样本的Z-值；
1.2 N：指定的第N 染色体；
1.3%chrN sample：待测样品第N 条染色体唯一比对序列数占
常染色体的百分比，通过高通量测序后软件分析获得；
1.4 Mean%chrN reference：参照样品第N 条染色体比例平均值；
1.5S.D.%chrN reference：参照样品第N 条染色体比例的标准偏差。
该公式中，影响唯一比对序列的因素包括GC 含量、检验覆盖度等，申请人应计算并统计检验覆盖度是否在正常范围内。参照样品的数量、来源等均对其数据产生影响，进而影响Mean%chrN
reference和 S.D.%chrN reference。因此，申请人需对参照样品的数据计算进行详述，并提供计算值。
2.被筛查孕妇所怀胎儿的染色体数量状况符合正态分布，即大概率为正常染色体数量，小概率事件为胎儿染色体非整倍体，
如图 1 所示：
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图 1 正态分布图
如图 1 可以看出，出现在Z- 值为正负 3 以外的数值，则有99.9%的可能为阳性，因此，通常将 Z-值 =3 定为阳性判断值分界点， Z-值 >3 或 Z-值 <-3 判断为胎儿染色体非整倍体阳性。申请人应当根据试验对Z- 值 >3 及 Z-值<-3 的情况分别进行说明。
鉴于并无 100%阴阳性分界点，一般来说，申请人应设定阳
性判断值灰区范围，灰区的设定应提交理论和实际试验结果的依
据，并在说明书【阳性判断值】和【检验结果的解释】项进行解
释说明，如：是否需要用产前诊断的方式进行最终确认，可能的
原因，是否需要孕龄再大时进行再次抽血复测等等。如无灰区设臵，也应提交理论和大样本量试验结果的依据。
在阳性判断值设定后，申请人应当选取一定数量阴、阳性真实临床样本进行试验验证，如与该公式不符，则应说明出现的问题及
详细的数据校正方式。
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（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。主要涉及两部分内容，申报产品
的稳定性和适用样本的稳定性研究。
1.申报产品的稳定性研究主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效
期后的研究资料。
2.适用样本的稳定性研究主要包括对含有游离DNA 的孕妇血浆的保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证以及血浆游离DNA
提取后储存条件的验证。可以在合理的温度范围内选择温度点
（温度范围），每间隔一定的时间段对储存样本进行检测，从而
确认样本的稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评
价。
应注意运输稳定性、开瓶稳定性等研究实际上均指经运输或开瓶后对产品效期及检测性能是否有影响，因此申请人应在试验设计中充分考虑上述因素。此外，产品稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。
（七）产品技术要求
拟定产品技术要求应符合《办法》、“公告”和《医疗器械产
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品技术要求编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014 年第 9 号）的相关要求。
如果拟申报试剂已有相应的国家 /行业标准发布，则企业标准
的要求不得低于上述标准要求。
（八）产品注册检验报告
根据总局第 5 号令要求，首次申请注册的第三类产品应在国
家食品药品监督管理局认可的、具有相应承检范围的医疗器械检
测机构进行连续三个生产批次样品的注册检验。该产品已有国家参
考品发布，在注册检验时应使用“高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体（ T21 、 T18 和 T13）国家参考品”进行。
（九）产品说明书
产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》（国家食品药品监督管理总局通告2014 年第 17 号）的要求，进口产品的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文
说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究
结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明参考文献的相关信息。
结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对说明书的重点内容进行详细说明。
1.【产品名称】
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建议按照如下方式命名：胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13 ）检测试剂盒（方法学）或胎儿染色体非整倍体（ T21/T18/T13 ）检测试剂盒（方法学）。
举例：胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13 ）检测试剂盒（半导体测序法）、胎儿染色体非整倍体（T21/T18/T13 ）检测试剂盒（可逆末端终止测序法）。
2.【预期用途】
2.1 第一自然段：预期用途描述，包括被测孕妇孕周特征，
样本类型等。
举例：该产品用于定性检测孕周为12+0 周及以上的孕妇外
周血血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸（DNA ），通过分析样本中的胎儿游离DNA 的 21 号、18 号及 13 号染色体数量的差异，对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、 18-三体综合征和13-三体综合征进行产前筛查。如试剂盒仅是测序步骤中的建库步骤，
则预期用途应描述为“构建测序文库”。
2.2 第二自然段：按照《体外诊断试剂说明书编写指导原则》
介绍临床适应症及背景，说明相关的临床或实验室诊断方法等，
应介绍产前诊断金标准。
2.3 第三自然段：明确该产品仅作为21 号、 18 号及 13 号染色体的产前筛查用途，其结果要由产前诊断金标准进行确认并遵
守相关法律法规及行业规范。
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3.【检验原理】
详细说明该产品检测母体胎儿游离DNA 判断染色体数量的
检测原理及方法学原理（必要时可用图示进行）。
4.【主要组成成分】
说明试剂盒所包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，
说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。
试剂盒中不包含但该项检测必需的组分，说明书中应列出相关试剂 /耗材的名称、生产企业、货号、注册证号/第一类医疗器械备案凭证编号（如有）及其他相关信息，测序芯片应明确型号。
5.【储存条件及有效期】
5.1 按照稳定性研究资料，说明试剂盒的效期稳定性、开瓶
稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等，应标明具
体的储存条件及效期。
5.2 按照《医疗器械说明书和标签管理规定》（总局令第5号）增加生产日期，使用期限或者失效日期。
6.【样本要求】
6.1 样本采集要求。
6.2 说明对采血管及抗凝剂的要求。
6.3 样本保存、运输及处理：孕妇外周血样本的保存条件（温度、保质期限）、运输条件、处理条件（如：多长时间内必须分
离血浆）；已分离的血浆样本的保存条件（温度、保质期限）、运
—17——
输条件、处理条件（如：核酸提取前的预处理）；冷藏 /冷冻样本检测前是否需恢复至室温，冻融次数的要求。
上述内容均需在稳定性研究资料中详述并用产品进行性能评
估验证。
7.【适用机型】
适用的测序仪器具体型号，并提供与仪器有关的重要信息以
指导用户操作。
8.【检验方法】
无论是否包含提取试剂或测序试剂，申请人应从头详细描述完成完整检测所需的全部步骤以指导用户正确操作，包括血浆游离DNA 的提取、文库构建、文库定量、片段扩增及上机测序。该
类产品操作程序较多，作为产品使用说明书该项内容应当尽量详细，以能够指导用户进行操作，其中应当包括各步骤的注意事
项及配合使用物品的技术参数、仪器厂家和型号（如PCR 仪，生物分析仪等）和反应条件，以半导体测序为例：
8.1 DNA 提取：DNA 提取方式、提取试剂盒货号及第一类医
疗器械备案凭证编号；DNA 提取液的短期和长期保存方式、冻融
次数等。
8.2 文库构建：末端修复、接头连接、缺口修复、 PCR 扩增；所构建的文库短期和长期保存方式，冻融次数等。
8.3 文库定量；描述对于定量后文库浓度和质量的要求，以
—18——
及何种情况进行文库的重新构建。
8.4 测序模板的制备：混合文库、PCR、模板富集。
8.5 上机测序：仪器准备、设臵及仪器使用相关参数。
9.【阳性判断值】
明确设定阳性判断值所使用的算法及验证参考值所使用的
样本例数及类型。如使用软件，则应明确软件名称、唯一标识号、生产厂家及医疗器械注册证书编号；如暂未取得医疗器械注册证书，应空出相应内容，在软件名称后注明（医疗器械注册证书编号：）。
10.【检验方法的局限性】
10.1 本试剂盒作为胎儿染色体非整倍体筛查检测，其结果
仅供临床参考，不能作为诊断的唯一依据。对患者的临床诊断应
采用金标准方法（染色体核型分析）并结合其症状/体征、病史及其他实验室检查等情况综合进行。本试剂盒不能对胎儿染色体
结构异常进行检测。
10.2 本试剂盒适用于孕妇外周血血浆样本检测，不适用于
其它样本检测。
10.3 胎儿游离D NA浓度在孕妇外周血中存在较大个体差
异，变化范围从2%到 30%不等且和孕周密切相关，因此若因胎
儿游离 DNA 浓度较低造成检验失败时，可待孕周较大时再次抽
血检测。
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10.4 以下几种情况的孕妇样品可能会出现假阳性或假阴性
结果，需要结合其他检测结果进行综合判断：
10.4.1 孕妇本人为染色体非整倍体疾病患者、其他染色体疾
病患者或携带者；
10.4.2 胎儿染色体异常中的平衡易位、嵌合型三体异常；
10.4.3 怀有双胎或者多胎（三胎及三胎以上）的孕妇；
10.4.4 近期接受过移植手术、干细胞治疗；近期接受过免疫
治疗或输注过异体血制品；
10.4.5 孕妇本人为肿瘤患者；
10.4.6 通过体外受精—胚胎移植（IVF-ET）方式受孕的孕妇；
10.4.7 体重严重超重的孕妇。
10.5 样本采集、运输及处理不当、未按说明书操作均有可能
导致假阳性或假阴性结果；描述在样本采集，保存、运输中需遵循的原则及注意事项，例如：
10.5.1 描述适用的抗凝采血管；
10.5.2 颠倒混匀时动作应轻柔，防止溶血；
10.5.3 全血离体后须进行血浆分离的时间；
10.5.4 血浆分离过程中注意不要吸到中间层的白细胞；
10.5.5 血浆样本是否能够进行反复冻融；
10.5.6 禁止将 XX 抗凝样本和血浆样本在室温状态下放臵；
10.5.7 血浆样本寄送采用的运输保存方式。
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高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
学习 通常一份测序结果图由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不同的碱基序列。测序图的两端（本图原图的后半段被剪切掉了）大约50个碱基的测序图部分通常杂质的干扰较大，无法判读，这是正常现象。这也提醒我们在做引物设计时，要避免将所研究的位点离PCR序列的两端太近（通常要大于50个碱基距离），以免测序后难以分析比对。 我的课题是研究基因多态性的，因此下面要介绍的内容也主要以判读测序图中的等位基因突变位点为主。 实际上，要在一份测序图中找到真正确实的等位基因多态位点并不是一件容易的事情。由于临床专业的研究生，这些东西是没人带的，只好自己研究。开始时大概的知道等位基因位点在假如在测序图上出现像套叠的两个峰，就是杂合子位点。实际比对了数千份序列后才知道，情况并非那么简单，下面测序图中标出的两
个套峰均不是杂合子位点，如图并说明如下： 说明：第一组套峰，两峰的轴线并不在同一位置，左侧的T峰是干扰峰；第二组套峰，虽两峰轴线位置相同，但两峰的位置太靠近了，不是杂合子峰，蓝色的C峰是干扰峰通常的杂合子峰由一高一略低的两个轴线相同的峰组成，此处的序列被机器误判为“C”，实际的序列应为“A”，通常一个高大碱基峰的前面1～2个位点很容易产生一个相同碱基的干扰峰，峰的高度大约是高大碱基峰的1/2，离得越近受干扰越大。一个摸索出来的规律是：主峰通常在干扰峰的右侧，干扰峰并不一定比主峰低。最关键的一点是一定要拿疑似为杂合子峰的测序图位点与测序结果的文本序列和基因库中的比对结果相比较；一个位点的多个样本相比较；你得出的该位点的突变率与权威文献或数据库中的突变率相比较。通常，对于一个疑似突变位点来说，即使是国际上权威组织大样本的测序结果中都没有报道的话，那么单纯通过测序结果就判定它是突变点，是并不严谨的，因一份PCR产物中各个碱基的实际含量并不相同，很难避免不产生误差的。对于一个未知
转录组高通量测序 2010-11-22 09:48 （第二代高通量测序技术-454） 转录组即特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。罗氏GS-FLX-Titanium第二代高通量测序仪平均读长超过 400bp，在测序读长上遥遥领先于其它第二代高通量测序仪，使其成为转录组学研究的首选测序平台，已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。 一、罗氏454测序技术在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在：（1）测序序列长，便于聚类拼接，可以对转录本进行从头组装（de novo assembly）。 （2）测序通量高，可以检测到低丰度转录本信息。 （3）可以对无基因组参考序列的新物种进行转录组测序，发现新的转录本和亚型。 （4）实验操作简单、结果稳定，可重复性强。无需进行克隆的文库构建，双链cDNA连接454接头后可以直接进行测序，实验周期短。 （5）测序数据便于进行生物信息分析，可以进行基因差异表达分析、鉴定基因的可变剪切以及预测新基因。 二、美吉公司在环境微生物生态多样性研究中的突出优势体现在： （1）拥有自主实验室和高通量测序平台，可以根据客户要求灵活安排实验，实验周期短，取样方便，质量可靠。 （2）技术人员经验丰富，可以稳定地进行总RNA的提取和双链cDNA的合成，可以根据顾客要求第一时间提供实验方案。 （3）有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为客户提供个性化的生物信息分析服务。 （4）开放式实验室，参与式服务。客户不但可以参与整个实验过程，而且可以参与生物信息分析，提供最为增值的售后服务。 三、服务流程 （1）客户提供样本背景信息、实验目的和实验预期。 （2）美吉公司设计实验方案，提供测序深度建议和生物信息分析建议。 （3）客户认可实验方案，双方签订项目合作协议。 （4）项目开始运作，美吉公司指定专人和客户保持无障碍沟通。 （5）项目结束，美吉公司提供标准结题报告。 （6）客户可以和美吉公司签订长期合作协议，享受折扣和VIP服务。 四、送样要求 （1）动物、植物、微生物组织： > 请提供足量的新鲜样品，样品量≥5g；植物材料应避免过老的组织，尽量用柔嫩部位。 > 新鲜程度要求：采样后将样品立即液氮速冻－80℃保存（保存期不超过1个月），干冰运输，运输时间不超过72h。 > 样本保存期间切忌反复冻融。
附件 胎儿染色体非整倍体（ T21、 T18、 T13） 检测试剂盒（高通量测序法）注册技术审查指 导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体 （T21、T18 、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料 的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审 评提供参考。 本指导原则是针对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的 具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相 应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行 充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注 册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满 足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由， 并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相 关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下 制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展， —1——
本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 胎儿染色体非整倍体（Fetal Chromosome Aneuploidies ）中 的21 三体、 18 三体、 13 三体（ Trisomies 21、 Trisomies 18、Trisomies13 ，即 T21 、T18、T13）是临床上最常见的染色体非整 倍体疾病。其对应的分别为 21-三体综合征（又称唐氏综合征，先天愚型 或 Down 综合征）、18-三体综合征（又称 Edwards 综合征）和 13-三体 综合征（又称 Patau 综合征），发病率分别约为 1/700、1/6000、1/10000，患儿绝大多数存在严重智力障碍及器官畸形。 产前筛查和产前诊断是为避免产生遗传缺陷患儿提供的手 段。常规的产前筛查方法包括：早孕期的超声与血清学联合筛查和中 孕期母体血清学筛查。筛查结果为高风险的孕妇经建议经产前诊断进 行最终确认，由孕妇知情选择。胎儿染色体异常的产前诊断金标准 为介入前产前诊断手术 ,是指通过绒毛取材术 /羊膜腔穿刺术 /经皮脐 血管穿刺术，取相应细胞采用细胞生物学方法对 胎儿染色体进行核型分析。 高通量测序方法检测胎儿染色体非整倍体的原理是：孕妇母体 血浆中存在胎儿游离DNA （cell-free DNA ，cfDNA ），长度约为 75bp— 250bp，几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞，其浓度和 孕周密切相关并以一定比例（ 5%— 30%）稳定存在于母体外周血 浆中。高通量测序方法通过取母体血浆提取包含正常母体和胎 —2——
基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？
(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法
Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量测序技术原理 2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。2007年，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件，让GS FLX的通量一下子提高了5倍，准确性和读长也进一步提升。 想当年，GS 20的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是454的创始人。上世纪90年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将Sanger测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。1999年，Rothberg的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（pyrosequencing）不仅简单，而且具有可扩展性。两个星期之后，Rothberg就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。 硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将DNA打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。受到其他学者乳液实验的启发，他也想将DNA放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。一个好汉三个帮。在Joel Bader等人的帮助下，Rothberg验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。就这样，乳液PCR终于诞生了。 对细菌的16S rDNA的V6/V3可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，测序的通量高，获得的数据量大，周期短，能更加全面的反映微生物群体的物种组成，真实的物种分布及丰度信息。 GS FLX 测序原理 GS FLX系统的测序原理和GS 20一样，也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧光信号释放偶联起来(图 1)。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。 Roche GS FLX System是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量基因组测序系统。在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
染色体异常基因检测 染色体 染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。人类体细胞有23对染色体，其中22对为男女所共有，称为常染色体；另外一对为决定性别的染色体，男女不同，称为性染色体；男性为XY，女性为XX。 染色体异常 体细胞或性细胞内染色体发生异常改变称为染色体异常，可分为数目异常和结构异常两大类。染色体异常可以自发地产生，称为自发突变；也可以通过物理的、化学的和生物的诱变作用而产生；还可以由亲代遗传所致。 染色体异常是导致出生缺陷、先天性遗传病、自然流产、不孕不育等的重要遗传因素。新生儿染色体异常的发病率为1/60。 常见的染色体微缺失/微重复综合征有300种，多会导致不同程度的发育异常和智力障碍，常伴有五官、内脏、四肢等方面的畸形，严重危害患者健康，给家庭和社会带来极大负担。 染色体异常基因检测 核子基因基于新一代高通量测序仪开发的染色体异常检测方法，可对流产组织、脐带血、绒毛、羊水、外周血等多种来源的样本进行测序分析，一次性检测23对染色体非整倍体、300种常见微缺失/微重复综合征及其他100kb以上的染色体异常，全面排查流产、胎儿异常、新生儿/儿童表型异常、不孕不育原因。 临床应用： 1、流产组织染色体异常检测：查明反复流产、异常妊娠的原因，指导再次生育。 2、胎儿染色体异常检测：排查胎儿异常的原因。 3、新生儿/儿童染色体异常检测：为发育异常、智力障碍，多发畸形等患儿排查染色体异常因素，为疾病确诊和治疗提供指导信息。 4、成人染色体异常检测：排查不孕不育、不良孕产史的遗传因素。 ????
技术优势： 1、全面覆盖：一次性检出23对染色体非整倍体和300种常见染色体微缺失/微重复综合征。 2、分辨率高：可检出100kb以上的染色体微缺失/微重复和低至5%的嵌合体。 3、准确度高：检测准确率>99% 4、自动解读：对检测到的微缺失/微重复，自动关联国际主流染色体异常数据库（Decipher、ISCA、OMIM、Clinvar）进行解读。 检测适用人群： 1、反复性流产，需要查明流产原因并确认再次生育方案的家庭。 2、超声显示结构异常或宫内发育迟缓的胎儿及父母。 3、临床表型为发育异常、智力障碍、多发畸形等患儿及父母。 4、具有染色体疾病家族史的夫妇及胎儿。 5、曾生育染色体疾病患儿的夫妇。 6、不孕不育或有不良孕产史的夫妇。 ????
案例一 虽然RNA-seq早已被大家所熟知，特别是在高通量测序越来越便宜的今天，但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。多个软件的使用，参数设置，参考基因组准备，输出结果的解读等等，都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。 哈哈，不用怕，有云生信，这都不是事儿！今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。不过在此之前，我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程，请不要拍砖头。图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程：根据实验设计，提取细胞RNA，并将RNA提交给测序公司，就可以坐等测序数据了。测序公司会根据客户提供的RNA进行建库，上机测序。拿到测序数据后，就到了我们大显身手的时候了。首先，我们要对测序结果做个简单的质量评估，剔除低质量的数据。然后，根据基因组数据（这里我们讲的是基因组数据已知的物种，基因组未知的有套独立的流程，这里不讲），将测序数据组装。根据组装结果，计算基因或转录本的表达量。最后，同芯片数据一样，我们可以根据表达量数据做很多分析，如差异表达分析，网络分析（包括蛋白互作网络，共表达网络等），也可以结合临床数据做分析（如预后，亚型分类、关联，药效等）。 图1. RNA-seq常规分析流程
叨叨完毕，进入正题。 进入尔云后，打开“测序数据处理”模块，我们会看到图2的结果。在这一模块，我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步：1、数据质控和过滤低质量数据；2、基因组组装，计算基因表达量。对于上面两部，尔云又根据是双端测序还是单端测序，分了两块。以edgeR 为例，输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表，有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。 图2. 测序数据处理模块 质控结束后，尔云会给出全部的质控结果。图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果，好多好多呀，可以下了慢慢看。建议主要关注一下xxx_qc_TABLE，该表格是对质控前后的数据统计，反应了测序的好坏。Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据，是第2步组装的输入文件。 图3.质控结果 组装完成后，会返回一个expression.txt的表达矩阵文件，该文件是下一步差异表达分析的输入分析。 得到表达矩阵后，我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。进入尔云的“差异分析”模块（如下图所示），它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。对于RNA-seq
附件 胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册技术 审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体 （T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下 制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展， —1—
本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 胎儿染色体非整倍体（Fetal Chromosome Aneuploidies）中的21三体、18三体、13三体（Trisomies 21、Trisomies 18、Trisomies13，即T21、T18、T13）是临床上最常见的染色体非整倍体疾病。其对应的分别为21-三体综合征（又称唐氏综合征，先天愚型或Down综合征）、18-三体综合征（又称Edwards综合征）和13-三体综合征（又称Patau综合征），发病率分别约为1/700、1/6000、1/10000，患儿绝大多数存在严重智力障碍及器官畸形。 产前筛查和产前诊断是为避免产生遗传缺陷患儿提供的手段。常规的产前筛查方法包括：早孕期的超声与血清学联合筛查和中孕期母体血清学筛查。筛查结果为高风险的孕妇经建议经产前诊断进行最终确认，由孕妇知情选择。胎儿染色体异常的产前诊断金标准为介入前产前诊断手术,是指通过绒毛取材术/羊膜腔穿刺术/经皮脐血管穿刺术，取相应细胞采用细胞生物学方法对胎儿染色体进行核型分析。 高通量测序方法检测胎儿染色体非整倍体的原理是：孕妇母体血浆中存在胎儿游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），长度约为75bp—250bp，几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞，其浓度和孕周密切相关并以一定比例（5%—30%）稳定存在于母体外周血浆中。高通量测序方法通过取母体血浆提取包含正常母体和胎 —2—
附件三生物信息学分析 一、基础生物信息学分析 1.有效测序序列结果统计 有效测序序列：所有含样品barcode（标签序列）的测序序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 注：合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。 图形示例为： 2.优质序列统计 优质序列：有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 图形示例为：
3.各样本序列数目统计： 统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。 结果示例为： 4.OTU生成： 根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。 5.稀释曲线（rarefaction 分析） 根据第4条中获得的OTU数据，做出每个样品的Rarefaction曲线。本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。 rarefaction曲线结果示例：
6.指数分析 计算各个样品的相关分析指数，包括： ?丰度指数：ace\chao ?多样性指数：shannon\simpson ?本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。 多样性指数分析结果示例： 注：默认分析以上所列指数，如有特殊需要请说明。 7.Shannon-Wiener曲线 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。绘制默认水平为：0.03。 例图：
8.Rank_Abuance 曲线 根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。结果文件默认为PDF格式（其它格式请注明）。 例图： 9.Specaccum物种累积曲线（大于10个样品） 物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况，是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。因此，通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分，在抽样量充分的前提下，运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。
导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。 摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序 技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。 图1：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
高通量测序基础知识汇总 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。 基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
染色体疾病的产前诊 断
染色体疾病的产前诊断 时间:2013-01-31 来源:网络综合整理 染色体病是指由染色体异常引起的疾病。据估计染色体异常占出生儿的 1/150～1/120。产前诊断中最常见的染色体异常有：染色体数目异常、染色体结构异常和微结构异常染色体疾病。据文献报道我国每年出生染色体异常的新生儿约10万人，在活婴儿中染色体异常者占0.3%。因此，普及染色体疾病的产前筛查和产前诊断，对降低出生缺陷的发生有着非常重要的意义。 下面就常见的染色体疾病及染色体病的产前筛查和染色体疾病的产前诊断作简单的阐述。 一、染色体数目异常疾病 染色体数目异常是临床上最主要的染色体病，其中以13号、21号、18号，X、Y染色体异常最为常见，占染色体非整倍体畸变95%以上。这些染色体异常占全部染色体病的80%～90%。常见的可以进行产前诊断的染色体病有以下几种。 （一）21三体综合征 21三体综合征（trisomy 21 syndrome）又称先天愚型综合征和唐氏综合征（Down syndrome），是胎儿和新生儿中最常见的非整倍体染色体异常。在新生儿中的发病率为1/600，在受精卵中为1/150。主要的临床特征为：智力低下，特殊面容，眼裂上斜，鼻梁扁平，舌大、外伸和流涎。约40%患者伴有先天性心脏病。 患者核型绝大多数（92.5%）为单纯型21三体，即47，XX，（xy），＋21； 4.8%为易位型（如14/21、21/22易位）；少数为嵌合型。单纯型21三体几乎都是新突变，与父母核型无关，它是减数分裂染色体不分离所致。单纯型21
三体的发生率与母亲的生育年龄密切相关，高龄孕妇生育21三体患儿的比例明显升高。 （二）18三体综合征 18三体综合征又称为Edward综合征，是一种严重的畸形，出生后不久死亡。患儿临床表现为头面、手足有严重畸形，头长而枕部凸出，犹如冬瓜样，称冬瓜头。眼距宽，眼球小，手紧握拳，足突出，向背部翘起，呈帆船状脚，95%的病例有先天性心脏病。 细胞遗体学检查80%患者核型为47，XY（或XX），＋18；另外10%患者为嵌合体，即46，XY（或XX）/47，XY（或XX），＋18；其余为各种易位，主要是18号与D组染色体的易位。 （三）13三体综合征 13三体综合征又称Patau综合征。新生儿中的发病率为1∶25 000。临床表现为智力发育障碍、小头、眼球小、前脑发育缺陷，常伴有腭裂。 细胞遗传学检查80%的病例为游离型13三体，核型为47，XX（或XY），＋13。其余的为嵌合型或易位型。易位型通常以13号和14号染色体罗泊逊易位居多。 （四）性染色体异常综合征 1. klinefelter syndrome综合征：又称先天性睾丸发育不全综合征。临床表现主要是小睾丸、无精子产生，97%患者不育。患者男性第二性征发育差，身材高，四肢长，可有智商低，精神异常及精神分裂症倾向。细胞遗传学检查绝大多数患者核型为47，XXY。大约有15%患者为嵌合体，其中常见的为46，XX/47，XXY；46，XY/48XXXY。额外的X是由于亲代减数分裂时X染色体不分离的结果。 2. XYY综合征：在男婴中发生率为1∶900。患者男性表型正常，身材高大，易兴奋，常有攻击行为。睾丸发育不全，生精过程障碍。XYY核型是父亲精子形成过程中第二次减数分裂时发生Y染色体不分离的结果。
无创胎儿染色体非整倍体产前检测技术的应用 无创胎儿染色体非整倍体产前检测技术是20多年来基因组学首个真正意义上能够进入临床应用领域的创新性突破，以下是搜集的一篇探究无创胎儿染色体非整倍体产前检测技术的，供大家阅读查看。 研究发现，孕妇外周血浆中存在胎儿游离DNA(cffD-NA)，长度在75bp和250bp之间，平均为166bp。怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在(7周建立胎儿胎盘循环)，其含量在5%～30%之间，能够通过高通量方法稳定检测出来。cffDNA以核小体形式稳定存在，在分娩后2h内快速消失从而不会影响下一胎的检测。因此，可以作为非创伤性产前检测的理想材料。 xx年8月，我院与中国医学遗传中心，湖南家辉遗传专科医院，北京贝瑞和康生物技术有限公司合作开展了“无创胎儿染色体非整倍体产前检测”，xx年8月-xx年8月，对257例孕13周～26周孕妇外周血进行了胎儿游离DNA检测。 检测的257例孕妇外周血中，253例正常，4例异常。其中:1例提示21-三体阳性，羊水结果证实(无假阳性，无假阴性)。1例提示18-三体阳性，羊水结果证实(无假阳性，无假阴性)。1例提示13-三体阳性，羊水结果正常(有假阳性，无假阴性)。1例提示母体性
染色体异常，对孕妇外周血进行染色体检查，结果为46，XXX/46，XX(60%∶40%)(无假阳性，无假阴性)羊水结果提示胎儿正常。阳性率为1.56%，灵敏度99%以上。 3.1国外临床试验结果:自1997年发现母体血液中存在胎儿游离DNA之后，无创伤的直接检测胚胎染色体异常成了一个重大的研究课题。xx年 ___中文大学和美国斯坦福大学的研究人员相继发表了应用高通量测序技术从母体血浆DNA中检测胎儿21三体的论文。xx 年 ___中文大学、美国Sequenom公司和VerinataHealth公司先后开展了应用高通量测序方法检测胎儿21、18、13号染色体的临床试验。 3.1.1 ___中文大学于xx年1月发表于英国医学 ___(BritishMedicalJournal)的文章表明，通过对753例高危孕妇的血浆DNA进行检测，准确检出86例唐氏综合征胎儿，灵敏度大100%，3例假阳性，无假阴性。 3.1.2Sequenom公司的临床结果于xx年3月发表于AJOG，该机构对449例高危孕妇的血浆DNA进行了检测，准确诊断出39例T21样本，1例假阳性，无假阴性，与 ___中文大学的结果非常相似。
染色体异常是什么原因引起的 *导读：染色体异常是什么原因引起的？染色体异常也称染色体发育不全，染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体，染色体病即染色体异常，故而导致基因表达异常机体发育异常。…… 染色体异常是什么原因引起的？染色体异常也称染色体发 育不全，染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体，染色体病即染色体异常，故而导致基因表达异常机体发育异常。 染色体异常的病因有以下几种： 1、物理因素：人类所处的辐射环境，包括天然辐射和人工辐射。天然辐射包括宇宙辐射，地球辐射及人体内放射物质的辐射，人工辐射包括放射辐射和职业照射等。 2、化学因素：人们在日常生活中接触到各种各样的化学物质，有的是天然产物，有的是人工合成，它们会通过饮食、呼吸或皮肤接触等途径进入人体，而引起染色体畸变。 3、生物因素：当以病毒处理培养中的细胞时，往往会引起多种类型的染色体畸变，包括断裂、粉碎化和互换等。 4、遗传因素：染色体异常常可以表现为家族性倾向，这提示染色体畸变与遗传有关。 5、自身免疫性疾病：自身免疫性疾病似乎在染色体不分离中起一定作用，如甲状腺原发性自身免疫抗体增高与家族性染色
体异常之间有密切相关性。 染色体异常分分类为：数量畸变包括整倍体和非整倍体畸变，染色体数目增多、减少和出现三倍体等；结构畸变染色体缺失易位倒位、插入、重复和环状染色体等又可分为常染色体畸变以及性染色体畸变和先天性睾丸发育不全等。 染色体异常治疗困难疗效不满意，导致的先天性智能障碍的治疗，也尚无有效药物，可尝试中药治疗与康复训练。所以该病的预防很重要，染色体发育不全治疗困难疗效不满意预防显得更为重要预防措施包括推行遗传咨询、染色体检测、产前诊断和选择性人工流产等，防止患儿出生。孕妇应该定期做产前检查，如果胎儿有问题，至少能及早发现。抽羊水诊断是能检验胎儿是否患有先天染色体缺陷的其中一个方法。
基于孕妇游离DNA的胎儿染色体非整倍体检测试剂质量控制技术评价指南（高通量测序法） (征求意见稿)
1.前言 对孕妇外周血中游离DNA进行高通量测序（Next Generation Sequencing, NGS)，并分析孕妇外周血中携带的胎儿的染色体突变异常风险，特别是染色体非整倍体变异的检测，是近几年出现的无创产前筛查新技术。 本指南主要是对企业研发、质检和产品应用关于质量控制和分析的指导性文件，应在遵循相关法规的前提下使用本指南。 本指南旨在规范申请人在胎儿染色体非整倍体检测试剂盒（高通量测序法）的产品设计开发、性能评价的诊断试剂技术指标和要求，并为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考，不代替注册申报资料的准备及撰写的指南和规范。 本指南仅作为技术指导性文件使用，需根据技术的发展和实际需要进行适当的更新，本指南不具有法律强制性。 2.适用范围 本指南所述的胎儿染色体非整倍体检测试剂（Noninvasive Prenatal Test, NIPT）是 采用低深度全基因组的高通量测序法，指的是直接通过对孕妇外周血中游离DNA进行文库构建、上机测序的第二代高通量测序方法，并不完全适用于高深度的目标片段测序法，SNP突变测序法和表观遗传学甲基化的测序法等其他高通量测序法。和本指南不相适应的其他高通量测序法，可以参照本指南的性能评价、质量控制的要求，并通过企业参考品，证明和本指南的要求具有实质性的等效性。 对于第三代单分子测序或其他测序方法，在文中并未涉及，但高通量测序技术发展迅速，第三代单分子测序方法在企业内部参考品设置、性能评估等，如有适用的方面，可以参照执行并证实实质性的等效性。
高通量测序与功能分析 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。 以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。 目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析， 几个概念： 16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。 OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如