奈韦拉平；依非韦伦等。[作用机制] 该类药的作用机理是通过与逆转录酶的非底物考试，大收集整理结合部位结合而抑制HIV逆转录酶的活性。[适应症] 用于治疗HIV 感染。
逆转录病毒（Retroviruses）归类于逆转录病毒科（Retroviridae），包括一大类含有逆转录酶（reversetranscriptase）的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科、泡沫病毒亚科和慢病毒亚科，每一亚科又有若干个属（表33-1）。肿瘤病毒亚科（oncovirinae）大多引起禽类、猫、鼠、猴等动物肿瘤，与人类疾病相关者有人类嗜T细胞病毒（humanT-celllymphotropicvirus,HTLV）；泡沫病毒亚科（spumavirinae）的致病作用尚不清楚；慢病毒亚科（lentivirinae）中的人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）则是艾滋病的病原体，正受到人类的广泛关注。三个亚科病毒的生物演化和亲缘关系见图33-1。 第一节人类免疫缺陷病毒 人类免疫缺陷病毒（HIV），是获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）的病原体。AIDS首次报道于1981年，1984年证实其病原为HIV。因病毒最初分离于淋巴腺综合征的同性恋患者血清，曾称之为淋巴腺病相关病毒（lymphadenopathy-associatedvirus,LAV），此后分别又有人类嗜T细胞病毒Ⅲ型（HTLV-Ⅲ）、AIDS相关病毒 （AIDS-relatedvirus,ARV）之称。1986年经国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）建议，将LAV、HTLV-Ⅲ和ARV统一命名为人类免疫缺陷病毒，俗称艾滋病病毒。HIV分HIV-1型和HIV-2型，前者引起全球AIDS流行，后者主要分离自西部非洲的艾滋病患者。HIV感染的范围在逐步扩大，我国自1985年发现首例AIDS以来，感染人数逐年快速增长，严重威胁着人类的身心健康，受到人们的广泛关注。 一、生物学性状 （一）形态与结构 成熟的病毒直径100~120nm、20面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶，后者包括逆转录酶、整合酶（integrase）和蛋白酶（protease）。HIV的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白（gp120）和相嵌蛋白（gp41）两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。包膜内面为P17构成的基质蛋白（matrix），其内为衣壳蛋白（P24）包裹的RNA。。 HIV基因组由两个拷贝的正链单股RNA组成，在其5’端可通过氢键结合构成二聚体。HIV的基因组成较其他逆转录病毒复杂，全长约9.7kb，含有gag、pol、env三个结构基因，以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调控基因（图33-3）。在基因组的5’端和3’端各含长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)，HIV的LTR含顺式调控序列，控制着前病毒基因的表达。在LTR区有启动子、增强子及负调控区。核酸杂交显示，HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。 1．结构基因 （1）gag基因：是编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因。其表达产物初为55kD的前体蛋白（p55），后在HIV蛋白酶作用下进一步裂解为p24、p17和p15。P24组成包裹在HIV核酸外的衣壳蛋白(capsid,CA)，其特异性较强，除HIV-1和HIV-2之间存在轻度交叉反应外，与其他逆转录病毒无交叉抗原成分；p17构成包膜内的基质蛋白；p15则可进一步裂解为与RNA结合的蛋白（p9和p7）。 （2）pol基因：编码HIV复制所需的酶类，诸如逆转录酶（p66/p51）、整合酶（p32）和蛋白酶。Pol基因有万分之一的突变率，对抗叠氮胸苷（具有抗病毒作用的核苷类似物）的HIV突变株的形成，即与pol上HIV逆转录酶基因
非核苷类反转录酶抑制剂依非韦伦的不良反应 发表时间：2013-10-12T14:19:33.827Z 来源：《医药前沿》2013年第27期供稿作者：霍秀明张炳镰刘丽慈赵颖朵辰黄宗平[导读] 一天一次的方便使用方法,在成人和大于3岁的儿童中均无需剂量调节和饮食限制等特点,使其广泛地使用于临床。霍秀明张炳镰刘丽慈赵颖朵辰黄宗平（佛山市妇幼保健院 528000） 【关键词】依非韦伦不良反应 【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）27-0365-01 依非韦伦是一种新型的HIV反转录酶抑制剂，该药与核苷类反转录酶抑制剂（D4T）或蛋白酶抑制剂（Nelfinavir）联合用于艾滋病治疗。根据试验结果证明,经过6个月的治疗之后,使用施多宁作为其治疗方案组成的92%患者的病毒载量降到可检测的水平之下(<500拷贝/毫升),而采用另一种非核普逆转录酶抑制剂(Nevirapine)的该项比例为83.1%,采用蛋白抑制剂(根据KaplanMeier评估数据)的该项比例为79.1%。在与NRTIS或蛋白酶抑制剂(Pls)联合使用时,依非韦伦是一个强有力的治疗伙伴,对于曾经治疗或未经过治疗的众多患者,包括儿童,上述联合治疗都能产生持续的治疗效果(抑制血浆Hlv一RNA和增加c氏细胞计数)。无论是否合用NRTIs,依非韦伦和茚地那韦的联合治疗都被证明是有效的。依非韦伦因其较少的副作用和药物相互作用;一天一次的方便使用方法,在成人和大于3岁的儿童中均无需剂量调节和饮食限制等特点,使其广泛地使用于临床。 依非韦伦是人类免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）的选择性非核甘类逆转录酶抑制剂，其适用于HIV-1感染的成人，青少年和儿童的抗病毒联合用药，临床上使用依非韦伦通常有良好的耐受性[1]，少数人出现皮疹，头晕，恶心，头痛，失眠，异梦等，极少数人出现幻觉，思维异常，精神障碍等，临床使用中出现的不良反应如下：⑴短暂性精神障碍。据报道某医院在抗病毒治疗中，有患者因服用依非韦伦发生精神异常。2005年5月～2011年1月在某院进行高效抗逆转录治疗人数2371例，其中服用依非韦伦1076例，发生精神障碍8例。本组8例患者既往无精神病史，无家族史。请专科会诊诊断为精神障碍，患者的年龄为24～46岁，发现精神异常后立即停止服用依非韦伦，静脉补液以促进药物从尿液中排泄降低血液中的药物浓度，并遵嘱给予使用短期的抗精神病药，本组8例患者经及时停用依非韦伦，短期小剂量使用抗精神病药后，患者的精神症状很快就消失，未遗留精神后遗症，更改治疗方案后随访半年，精神症状无复发。这说明依非韦伦能引起精神障碍，虽然此不良反应较少见停药后无后遗作用，但也应引起医务人员的注意，密切观察其行为表现，进行对症治疗，有针对的实施护理措施[2]。 ⑵剥脱性皮炎型药疹。患者接受司他夫定、拉米夫定、依非韦伦联合方案抗逆转录病毒治疗后22天出现全身剥脱性皮炎型药疹，后改用替诺福韦、拉米夫定、克力芝未再出现变态反应。故可确定导致患者出现全身剥脱性皮炎型药疹的药物为司他夫定及依非韦伦。司他夫定主要的不良反应为骨髓抑制、周围神经损害、乳酸酸中毒、胰腺炎，未见有严重过敏报道；而依非韦伦常见的不良反应为神经系统症状如失眠、多梦、幻觉，但可有20%患者出现变态反应[3]，而且可引起依非韦伦相关杂原允综合征[4]。因此可以断定导致本例剥脱性皮炎的药物为依非韦伦。根据症状使用抗过敏药和抗菌药物后，患者全身红色皮疹逐渐变淡，表皮脱落，双足部皮肤呈袜套样剥离，病情逐步好转，后改用替诺福韦、拉米夫定、克力芝联合抗逆转录病毒治疗，随访至今患者无皮疹出现，病情稳定[5]。 依非韦伦是国家提供的免费艾滋病治疗用药之一，适用于HIV-1感染的成人、青少年和儿童的抗病毒联合用药，临床使用依非韦伦有良好的耐受性，现作为艾滋病合并结核感染的患者或合并肝功能损害的患者首选组合用药之一，在越来越多患者使用依非韦伦治疗艾滋病的同时，亦应该重视其不良反应。 参考文献 [1] 李秋，王珊.抗病毒药物的研究进展[J].医药导报，2011，30（6）：732 ～ 735. [2] 黄翠英.8例依非韦伦致短暂性精神障碍护理体会[J].医药前沿，2013，2，242～243 [3] Ananworanich J,Moor Z,Siangphoe U,et al,Incidennce and risk factors for rash in Thai patients ratients randomized toregimens with nevirapine,efavirenz or both drugs[J].AIDS,2005,19(2):185-192 [4] Colebunders R,Vanwolleghem T,Meurrens P,et al.Efavirenz-Associated Stevens-Johnson Syndrome[J].Infection,2004,32:306-307 [5] 方鹏.依非韦伦致剥脱性皮炎型药疹1例[J].现代中西医结合杂志，2012,21，2020
含N芳杂环类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂及埃博拉病毒侵入 抑制剂的研究 艾滋病,又称为“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS),是一种广为人知的严重威胁着人类生命健康的传染性疾病。自1981年被首次报道以来,已造成3500多万人的死亡。 最新的权威数据显示,近年来艾滋病在全球范围内仍属高发态势,其防控形势依然严峻。人类免疫缺陷病毒HIV(Humanimmunodeficiencyvirus)是造成人类艾滋病感染的罪魁祸首。 它的感染破坏人体免疫系统功能,继而并发机会性感染和恶性肿瘤,最终导致感染者死亡。HIV属于逆转录病毒,具有两个亚型,其中,HIV-1是全球范围内导致艾滋病感染的主要类型。 HIV-1病毒的复制周期非常复杂,主要包括吸附、融合、逆转录、整合、转录、翻译、装配、出芽和释放等一系列过程。这些环节也为我们对HIV病毒的复制进行药物干扰提供了机会。 其中,逆转录酶(Reversetranscriptase,RT)由于在病毒生命周期中极为重要的作用,成为一个非常成熟的抗HIV药物作用靶点。针对逆转录酶的非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)因其高活低毒、选择性强等优点,在临床治疗中广泛应用。 二芳基嘧啶类(DAPYs)化合物是NNRTIs的经典代表,已经有两个化合物依曲韦林(ETR)和利匹韦林(RPV)作为新一代药物上市。但相继出现的耐药病毒株、药代动力学性质不佳以及毒副作用等问题严重限制了其应用。 因此,研发对靶点结合作用更强、理化性质更优的新型的HIV-1NNRTIs,以提
二芳基嘧啶类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂的结构优化及构 效关系研究 人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)是引起艾滋病(AIDS)的主要病原体。以HIV-1逆转录酶(HIV-1 RT)为靶点,设计高效低毒RT抑制剂已成为抗艾滋病药物研究领域的热点。 其中,二芳基嘧啶类(DAP Ys)非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)更是被业界广泛关注。目前有五种NNRTIs被FDA批准用于AIDS临床治疗,其中依曲韦林(Etravirine)和利匹韦林(Rilpivirine)都属于DAPYs。 本课题组前期对DAP Ys左翼芳环与嘧啶母核的连接基进行了系统的结构修饰,得到一批高活性且具有强抗耐药性抗HIV化合物。本论文结合DAP Ys已有的构效关系,利用计算机辅助药物设计手段,对DAP Ys左翼连接基进行进一步结构修饰,设计合成了三大系列DAP Y类化合物。 (1)在CH(OH)连接基上引入疏水性烃基,合成得到一系列CR(OH)-DAP Ys目标化合物FDUla-r,活性测试结果表明,大部分化合物对野生型HIV-1展示中等程度的抑制活性(EC5o=7.21～0.067μM),其中化合物FDUld抗HIV活性最强且具有较高的选择指数(EC50=0.067 μM, SI=592),是参考药物地拉韦啶的12倍,奈韦拉平的1.5倍。然而,所有目标物对双变异病毒株K103N+Y181C均未展示明显的抑制活性。 (2)在CH2连接基上引入一个卤原子(氯、溴),合成得到一系列CHX-DAPYs 目标化合物FDU2a-s,活性测试结果表明,所有化合物对野生型HIV-1显示良好的抑制活性(EC50=7.88～0.005μM)。化合物FDU2f和FDU2g抗HIV活性低达纳摩尔级别且具有很高的选择指数,EC5o值分别为0.005μM、0.009μM。
逆转录酶（AMV）使用说明 货号：RT1060 规格：200U/500U/1000U 保存:-20℃保存，避免反复冻融，保质期为2年。 产品内容： 产品组成RT1060-200RT1060-500RT1060-1000逆转录酶（AMV）20μl50μl100μl 10×AMV Reaction Buffer50μl150μl300μl DTT30μl80μl150μl 产品简介： 逆转录酶（AMV）从Avian Myeloblastosis Virus分离出来，经过高度纯化，不含核酸酶。可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。 逆转录酶（AMV）一个活性单位U定义为：在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。 使用说明： 合成第一链cDNA的步骤 以下试剂客户自己提供 dNTPs(10mM)
引物（Oligo dT（18）或随机引物或特异性引物 无核酸酶双蒸水 RNA模板 RNase抑制剂 RT反应（20μl体系）： 1．使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s； 2．取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入 2~5μg RNA Xμl 引物*1μl 【引物*：Oligo dT18(10μM)或随机引物(50ng/μl)或特异性引物(2μM)】 dNTPs(10mM)1μl 补加无核酸酶的双蒸水至总体积15.5μl 3．65℃保温5min，然后冰浴5min； 4．往步骤3的PCR管中依次加入下列组份 RNase抑制剂(40u/μl)0.5μl 10×AMV Reaction Buffer2μl DTT(200mM)1μl
逆转录和逆转录酶 1.逆转录酶的发现 在1970时，当科学家霍华德·马丁·特明和戴维·巴尔的摩两人各自都从酵素中发现反转录的反应，将此命名为逆转录酶，此种反转录的机制才被当时的主流接受。 逆转录酶首先是由霍华德·马丁·特明在劳氏肉瘤病毒中发现的，并且1970在麻省理工学院由戴维·巴尔的摩独立从两种R N A肿瘤病毒：R-M L V 以及在一次劳氏肉瘤病毒中分离出来。由于这些成就，两人在1975年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。 后来发现，逆转录酶不仅存在于某些R N A病毒，也存在于哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞。 2.逆转录的过程 逆转录酶的作用是以d N T P为底物，以R N A为模板，t R N A(主要是色氨酸t R N A)为引物，在t R N A3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与R N A模板互补的c D N A单链，它与R N A模板形成R N A-c D N A杂交体。 随后又在逆转录酶的作用下，水解掉R N A链，再以c D N A为模板合成第二条D N A链。至此，完成由R N A指导的D N A合成过程。 逆转录的简单过程 3.逆转录酶的生理功能 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖R N A的D N A聚合酶，即以R N A 为模板催化D N A链的合成。合成的D N A链称为与R N A互补N A（c D N A）。大多数逆转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下三种活性。 （1）D N A聚合酶活性以R N A为模板，催化d N T P聚合成D N A的过程。此酶需要R N A为引物，多为赖氨酸的t R N A，在引物t R N A3'－末端以5' →3'方向合成D N A。 （2）R N a s e H活性（R N A酶）由反转录酶催化合成的c D N A与模板R N A 形成的杂交分子，将由R N a s e H从R N A5'端水解掉R N A分子。 （3）D N A指导的D N A聚合酶活性以反转录合成的第一条D N A单链为模板，以d N T P为底物，再合成第二条D N A分子。 除此之外，有些逆转录酶还有D N A内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体D N A中有关。 4.研究意义
产品名: Lersivirine 修订日期: 6/30/2016产品说明书 化学性质 产品名: Lersivirine Cas No.: 473921-12-9 分子量: 310.35 分子式: C17H18N4O2 别名: UK-453061;UK453061;UK 453061 化学名: 5-[3,5-diethyl-1-(2-hydroxyethyl)pyrazol-4-yl]oxybenzene-1,3-dicarb onitrile SMILES: CCC1=C(C(=NN1CCO)CC)OC2=CC(=CC(=C2)C#N)C#N 溶解性: Soluble in DMSO 储存条件: Store at -20°C 一般建议: For obtaining a higher solubility , please warm the tube at 37°C and shake it in the ultrasonic bath for a while.Stock solution can be stored below -20°C for several months. 运输条件: Evaluation sample solution : ship with blue ice All other available size: ship with RT , or blue ice upon request 生物活性 靶点 : Microbiology & Virology 信号通路: Reverse Transcriptase 产品描述: Lersivirine （UK-453061）是全新的人体免疫缺陷病毒（HIV ）逆转录酶非核苷类抑制剂（NNRTI ），IC50值为119 nM[1]。 HIV 是一种逆转录病毒，导致艾滋病毒感染和获得性免疫缺陷综合征（AIDS ）。它可以感染人的免疫系统中重要的细胞，如辅助性T 细胞和树突状细胞。在感染过程中， 艾滋病毒的逆
逆转录实验说明 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 RNA保存：为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及
关于逆转录试剂的那些事 逆转录（reverse transcription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。是RNA病毒的复制形式，需逆转录酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。 逆转录与反转录严格意义上来说没有什么区别，但是逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程；反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA 互补DNA(complementary DNA,cDNA)。逆转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 逆转录酶 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反转录酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 BIOG Super Reverse Transcriptase是公司美国团队在西雅图的实验室研发出的一款具有卓越性能的逆转录酶。利用基因工程技术，我们成功地将BIOG Super的热稳定性大幅提高，即使在摄氏50多度时也有较好的逆转录表现，从而有效克服了RNA模板二级结构对逆转录反应的影响。与其它品牌的逆转录酶相比，BIOG Super与RNA模板具有更高的亲和力，更容易获得完整的cDNA片段，并可检测到低至1pg总RNA 中的目标片段，特别适合于总RNA量较少以及目标RNA拷贝数较低情况下的逆转录。 成分反应体系 组分2000单位10000单位 5×BIOG RT Buffer500ul500ul BIOG Super Reverse Transcriptase 10ul50ul RNase free ddH2O to20μl 5×BIOG RT Buffer4μl dNTP Mixture(10mM each)1μl Gene Specific Primers(2μM)1μl RNase inhibitor(40U/μl)1μl BIOG Super Reverse Transcriptase1μl 模板RNA100pg-5μg
逆转录-聚合酶链反应中文实验方法 作者：佚名来源：本站原创 2004-12-20点击：6478 【字体：小大】 逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为4 2℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cD NA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的
HIV核苷类逆转录酶抑制剂的研究进展 摘要核苷类逆转录酶抑制剂是核苷或核苷酸结构衍生物，通过竞争性地抑制天然核苷与HIV-1逆转录酶的结合，阻碍前病毒DNA的合成。本文综述了核苷酸类HIV 逆转录酶抑制剂的几种代表性药物的作用原理。 关键词：艾滋病；逆转录酶抑制剂；药物治疗 1 引言 艾滋病病毒(HIV)是一种RNA病毒。该病毒的表面是双脂膜。膜中包裹着2个单链RNA和一些重要的酶(如逆转录酶、蛋白水解酶、整合酶)及结构蛋白质(p24，p17，p7等)。 核苷酸类HIV逆转录酶抑制剂作用于逆转录酶与其天然底物核苷结合的活性部位。该类药物是天然核苷的类药物，进人体内后经过多步磷酰化反应，代谢为真正的活性分子三磷酸化核苷(NRTI—PPP)，它们与内源性的dNTP竞争性地作用于酶的底物活性部位。由于NRTI．PPP的结构极为相似于dNTP底物，酶会将这类药物误认为是底物并将其嵌人正在延长的DNA链中一旦这些药物进人了DNA链，由于药物分子的结构中没有可与下一个dNTP进行3’—5’相连的3’—羟基。因而阻断了病毒DNA链的延长，也就抑制了HIV的复制。 2 几种核苷酸类HIV逆转录酶抑制剂 2.1 齐多夫定 齐多夫定通过抑制病毒DNA的合成抑制病毒复制，可使CD4细胞计数升高，亦可减少病毒的垂直传播 J。但不良反应较多且严重，长期应用，特别是单剂治疗，可引起骨髓抑制(贫血和中性粒细胞减少)。齐多夫定亦可因为病毒基因突变而引起耐药性。 2.2 地丹诺辛 地丹诺辛(Didanocine，又名去羟肌苷，DDI)通过细胞酶作用转化成有抗病毒活性的化合物双脱氧三磷酸腺苷(ddATP)，干扰逆转录酶而阻止病毒的复制而使艾滋病患者的CD4细胞数目增多，从而延长患者的生存时间并减少致病菌感染发生率。 2.3 扎西他宾 扎西他宾(Za／citabine又名Hivid)能在细胞内磷酸化成有活性的三磷酸代谢物而抑制表现为HIV的细胞病。一些体外的测定方法显示，它是目前临床应用中有效的核苷类似物，在0．5~mol／L浓度时就能完全抑制人体T淋巴细胞内HIV 的复制。与齐多夫定合用时，除有协同作用外尚有加成作用。 2.4 司他夫定 司他夫定(Stavudine又名Zerit)结构和作用机理与齐多夫定相似。在细胞内司他夫定和齐多夫定都能整合人病毒的DNA，但司他夫定的速率较慢。体外试验，本品对HIV．1和HIV-2有同等抑制作用，有效浓度为0．01 g／ml，对齐多夫定产生耐药性的HIV．1病毒株，本品也有抑制作用，但对乙型肝炎病毒和病原性杆菌无抑制作用。临床上适用于对齐多夫定、去羟肌苷等不能耐受或治疗无效的艾滋病及其相关综合征。 2.5 拉米夫定 拉米夫定(Lamivudine，商品名Epivir)是一种半合成二脱氧核苷酸类似物，可抑制HIV逆转录酶。在体外，本品对分离的HIV一1、HIV-2和齐多夫定耐药毒株具有活性。与齐多夫定连用时有协同作用["。临床上与其他抗病毒剂联用治疗进
非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂—— 二芳烃取代苯并咪唑类衍生物的设计、合成和活性评价 秦炳杰1, 周婷1, 陆虹2, 姜世勃2, 谢蓝1* (1. 军事医学科学院毒物药物研究所, 北京 100850; 2. 美国纽约血液中心, 纽约 10065) 摘要: 为寻找新型抗HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂先导物, 靶向设计、合成和评价了苯并咪唑类系列化合物的抗HIV活性。在27个目标化合物中发现了3个苯并咪唑类化合物(A6、B3、B6) 具有良好的抗HIV活性, EC50值分别为15.33、9.81和1.37 μmol·L?1; 并获知该系列化合物的初步构效关系。抗HIV的二芳烃取代苯并咪唑类活性化合物, 可作为进一步结构优化、发现高活性新结构抗HIV新先导物的新起点。 关键词: HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂; 二芳烃取代苯并咪唑衍生物; 合成 中图分类号: R916.1 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2009) 11-1233-11 Design, synthesis and biologic evaluation of diarylbenzimidazole derivatives as novel HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors QIN Bing-jie1, ZHOU Ting1, LU Hong2, JIANG Shi-bo2, XIE Lan1* (1. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China; 2. Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York 10065, USA) Abstract: Twenty seven new diarylbenzimidazole derivatives (A1?A21, B1?B6) were designed, synthesized, and evaluated in MT-2 cell line as potential HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) agents with a new skeleton based on molecular modeling technique and hit 1,2-diarylbenzimidazole A1 (EC50 69.9 μmol·L?1). Hence, 1,2-diarylbenzimidazoles A6 and B3, and 1,6-diarylbenzimidazole B6 showed obvious potency against HIV-1 replication in MT-2 cell line with EC50 values of 15.33, 9.81 and 1.37 μmol·L?1 respectively. All target compounds were synthesized commonly from substituted 2-nitroanilines by 1?3 steps under mild reaction conditions. Current studies provided preliminary SAR, thus indicating that 1,6-diaryl substitution on the benzimidazole ring would be a right direction for further modification. Furthermore, the docking studies demonstrated that B6 could fit well into the HIV-1 NNRTI binding pocket with a similar binding orientation and conformation to that of TMC278, a promising NNRTI candidate in clinical trial III, Therefore, active compound B6 could serve as a new starting point to develop a series of 1,6-diarylbenzimidazole derivatives as HIV-1 NNRTI agents with a novel skeleton. Key words: HIV-1 NNRTIs; diarylbenzimidazole derivative; synthesis 随着新一代NNRTI类抗HIV-1药物Etravirine (TMC125) 研制成功, 非核苷类逆转录酶抑制剂又成为近年来抗HIV-1病毒新药研究领域的一个亮点。该 收稿日期: 2009-05-13. 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (20472114); 北京市自然科学基金资助项目 (7052057). *通讯作者Tel / Fax: 86-10-66931690, E-mail: lanxieshi@https://www.doczj.com/doc/af17749324.html, 类抗HIV-1药物具有结构多样、高效、低毒的特点, 且可与其他药物有协同作用。上世纪90年代该类药物有3个相继问世: 奈韦拉平 (nevirapine)、依非维仑(efavirenz) 和地拉韦定 (delavirdine) (图1)。但不久发现它们易产生耐药性, 给临床应用带来了一定限制。于是, 耐药性问题成为新一代NNRTIs药物研究的重点。不同结构类型的NNRTIs类化合物相继报道
[15]王庆利,尚雪原,纪建波,等.低分子肝素的抗过敏作用[J ].中 国药学杂志,2000,35(2):95-98. [16]Ho well AL ,Taylor TH ,M iller J D ,et al .Inhibition of HIV -1infectivity by l ow molecular weight heparin .Res ults of in vitr o studies and a pilot clinical trial in patients with advanced AID S [J ].Int J Clin Lab R es ,1996,26(2):124-131. [17]Barz u T ,Level M ,Petitou M ,et al .Preparation and anti -HIV activity of O -acylated heparin and dermatan s ulfate derivatives with l ow antico -agul ant effect [J ].J M ed Chem ,1993,36:3546-3555. [18]Saivin S ,Peritou M ,Lormeau JC ,et al .Pharmacological properties of unfractionated heparin but yryl derivative with long las ting effect [J ].J Lab Clin Med ,1992,119:189-196. [19]崔慧斐,姬胜利,王凤山,等.高度硫酸化的低分子肝素的制备 及其降血脂作用研究[A ].2000年中国药学会学术年会论文集(下册)[C ].北京:中国药学会,2000.905-906. [20]Gl usa E ,Barthel W ,Schenk J ,et al .Effects of a supers ulfated lo w molecular weight heparin (IK -SSH )on different hemos tatic parameters [J ].Haemos tasis ,1998,28(1):45-56. [21]Masahiro G ,Tomoko M ,Shinya K ,et al .Terminally alkylated heparin . 2.Potent antiproliferative agent for vascular smooth muscle cell s [J ].Biomacromolecules ,2001,2(4):1178-118 3.[22] Youngro B ,Lee Y K .Oral delivery of macromolecules [P ].U S :6245753,2002. [23]Sanders on RD ,Pumphrey CY .Neogl ycan anticancer agents and us es thereof [P ].US :479139,2002. 核苷类抗病毒药物研究进展 汤雁波,李卓荣 (中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所,北京100050) 摘 要:核苷类药物在病毒类疾病的治疗中占据重要位置。此文综述了核苷类抗病毒药物的研究开发状况、作用特点及新型核苷类抗病毒药物的研究策略等。 关键词:核苷类药物;抗病毒;人类免疫缺陷病毒;乙型肝炎病毒;前药 中图分类号:R978.7 文献标识码:A 文章编号:1005-1678(2004)01-0044-04 The development of nucleoside and nucleotide analogues for antiviral TANG Yan -bo ,LI Zhou -rong (Institute of M edic inal Biote chnology ,Chinese Ac adem y of Medical Sciences /Peking Union Medical College , Be ijing 100050,China ) 收稿日期:2003-03-19;修回日期:2003-10-18 作者简介:汤雁波(1977-),男,安徽合肥人,在读硕士研究生,主要从事药物合成方面的研究。 核苷类药物作为病毒类疾病的主要治疗药,近年来受到了广泛关注,特别是拉米夫定、阿昔洛韦等高效低毒抗病毒药物的研制成功,为广大患者带来了福音。然而,临床上使用的抗病毒药物仍然存在毒副作用大、耐药性等问题,另外,诸多病毒类疾病如肝炎、艾滋病等仍缺乏有效的防治手段,这些都预示着抗病毒药物的研究依然是当务之急。本文从核苷类抗病毒药物的分类、现状以及研究方法入手,简述该类药物的研究进展。 1 核苷类抗病毒药物的分类及研究现状 至2002年底,临床用于治疗病毒类疾病的核苷类药物有以下19种:齐多夫定(AZT )、司他夫定(d4T )、扎西他宾(ddC )、拉米夫定(3TC )、阿巴卡韦(ABC )、地丹诺辛(ddI )、泰 诺夫韦DF [bis (POC )PMPA ]、碘苷(IDU )、阿昔洛韦(ACV )、泛昔洛韦(VACV )、喷昔洛韦(PCV )、伐昔洛韦(FCV )、更昔洛韦(GCV )、三氟胸苷(TFT )、溴乙烯去氧尿苷(BVDU )、西多福韦(CDV )、阿糖腺苷(Ara -A )、单磷酸阿糖腺苷(Ara -Amp )、Valgan -ciclovir 。按其临床适应证的不同分为如下几类[1,2],见表1。 表1 核苷类抗病毒药物的分类类 别 药 物 抗逆转录酶病毒药物 齐多夫定、地丹诺辛、司他夫定、 拉米夫定、阿巴卡韦、扎西他宾、泰诺夫韦DF 抗肝炎病毒药物拉米夫定、单磷酸阿糖腺苷抗疱疹类病毒药物 阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦、阿糖腺苷、碘苷(IDU )、三氟胸苷、溴乙烯去氧尿苷、西多福韦、单磷酸阿糖腺苷 抗巨细胞病毒药物 更昔洛韦、西多福韦、Valganciclovir
科技名词定义
程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，逆转录在体内，反转录在体外。 2．逆转录酶与逆转录过程 逆转录过程由逆转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA （cDNA）。逆转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物，多为赖氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA 分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。 逆转录的简要过程表示如下： 逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA桪NA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。 3．生物学意义 逆转录的发现有重要的理论意义和实践意义。 （1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA