谷氨酸脱氢酶测定试剂盒使用说明
分光光度法货号：BC1460
规格：50管/48样
产品内容：
提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，4℃保存；
试剂三：粉剂×1支，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存。
产品简介：
GDH和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。GDH催化NH4+、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD+，引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率，计算GDH活性。
试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：
提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超
声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3.血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）工作液的配制：临用前将试剂二、三、四转移到试剂一中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用；
（2）取0.05mL样本和1mL工作液于1mL比色皿中，混匀，加工作液的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。
GDH活性计算：
1、血清（浆）中GDH活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=675×ΔA
2、组织、细菌或细胞中GDH活力的计算:
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=675×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GDH（nmol/min/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=675×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。GDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.35×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.05×10-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol /cm；d：比色
皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
血清尿素氮BUN谷氨酸脱氢酶测定法作业指导书 1.实验原理 脲酶-谷氨酸脱氢酶（Urease-GLDH）连续监测法。尿素被脲酶水解产氨。在NADH的存在下，氨和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，NADH同时被氧化成NAD＋。NADH的减少和样品中尿素浓度成正比。本法是连续监测法。 脲酶 尿素+ 2H2O 2 NH4＋+ 2 HCO3－ 谷氨酸脱氢酶 NH4＋+α-酮戊二酸+NADH L-谷氨酸+NAD＋+H2O 2 标本： 2.1 病人准备：血清无特殊要求。要留取24小时尿样。 2.2 类型：血清、血浆（不可使用肝素铵）、新鲜尿液。无溶血和凝块的血清，如果必须使用血浆，建议使用
无铵离子的抗凝血剂，如EDTA和肝素钠。用新鲜尿液作样品时，用蒸馏水作1:100稀释。 3. 标本存放：血清或血浆稳定性：4～25℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1年。尿液稳定性：20～25℃保存可稳定2天；4～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1个月。 4. 标本运输：常温条件下保存运输。 5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。 6. 实验材料 6.1 试剂：申能尿素测定试剂盒（142 3107170 1 试剂1：6×64ml＋试剂2：6×16ml） 6.1.1 试剂组成 试剂1： Tris缓冲液pH7.8 120mmol/L α-酮戊二酸7mmol/L ADP 0.6mmol/L 谷氨酸脱氢酶≥1000U/L
脲酶≥6000U/L 试剂2： NADH 0.25mmol/L 6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 6.1.3 试剂稳定性与贮存 试剂保存于2～25℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂不可冰冻。 6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 6.1.5 注意事项：此试剂为体外诊断用。不要入口，吞下有害。保护剂为叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜，与下水管中的铅反应形成爆炸性化合物，即使只含有少量的叠氮钠，如果排向下水道请用大量的水冲洗。应采取必要的预防措施使用试剂。 6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品
乳酸脱氢酶释放法lactate dehydrogenase release assay 碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)或乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit)，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。 本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。 细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH 的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。 本试剂盒的基本原理是，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。该酶联反应原理的示意图如下： 可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。 包装清单： 保存条件： -20℃保存，一年有效。C0016-3需注意避免反复冻融。C0016-4需避光保存。试剂盒解冻后可以短期4℃存放，2-3天内有效。 注意事项： 冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活，4℃可放置2-3天。建议样品准备好后尽量当天完成测定。 如果检测细胞培养液中的乳酸脱氢酶，由于血清含有乳酸脱氢酶，建议血清的使用浓度不要超过1%，并最好使用热灭活血清。如果一定需要使用10%血清，在检测时一定要设置没有细胞，但加入了相同体积培养液的对照孔，以用于消除背景。 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。
血清尿素氮BUN谷氨酸脱氢酶测定法 1.实验原理 脲酶-谷氨酸脱氢酶（Urease-GLDH）连续监测法。 尿素被脲酶水解产氨。在NADH的存在下，氨和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，NADH同时被氧化成NAD＋。NADH 的减少和样品中尿素浓度成正比。本法是连续监测法。 脲酶 尿素+ 2H2O 2 NH4＋+ 2 HCO3－ 谷氨酸脱氢酶 NH4＋+α-酮戊二酸+NADH L-谷氨酸+NAD ＋+H 2O 2 标本： 2.1 病人准备：血清无特殊要求。要留取24小时尿样。 2.2 类型：血清、血浆（不可使用肝素铵）、新鲜尿液。无溶血和凝块的血清，如果必须使用血浆，建议使用无铵离子的抗凝血剂，如EDTA和肝素钠。用新鲜尿液作样品时，用蒸馏水作1:100稀释。
3. 标本存放：血清或血浆稳定性：4～25℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1年。尿液稳定性：20～25℃保存可稳定2天；4～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定1个月。 4. 标本运输：常温条件下保存运输。 5. 标本拒收标准：细菌污染的标本。 6. 实验材料 6.1 试剂：奥林巴斯尿素测定试剂盒试剂1：＋试剂2：6.1.1 试剂准备：试剂为即用式。 6.1.2 试剂稳定性与贮存 试剂保存于2～25℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂不可冰冻。 6.1.3 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 6.1.4 注意事项：此试剂为体外诊断用。不要入口，吞下有害。保护剂为叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜，与下水管中的铅反应形成爆炸性化合物，即使只含有少量的
乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（乳酸底物法） 适用范围：用于体外定量测定人体血清中乳酸脱氢酶的活性。 1.1试剂盒包装规格 试剂1：1×25ml，试剂2：1×5ml；试剂1：2×60ml，试剂2：2×12ml； 试剂1：3×40ml，试剂2：3×8ml；试剂1：4×60ml，试剂2：4×12ml； 试剂1：2×400ml，试剂2：1×160ml；试剂1：1×10L，试剂2：1×2L； 试剂1：2×40ml，试剂2：2×8ml。 1.2试剂盒主要组成成分 2.1 外观 液体双试剂：试剂1无色至浅黄色澄清液体，试剂2无色至浅黄色澄清液体。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不得低于标示体积。 2.3 试剂空白
2.3.1试剂空白吸光度：在37℃、340nm波长、1cm光径条件下，试剂空白吸光度应不大于0.5。 2.3.2试剂空白吸光度变化率：在37℃、340nm波长、1cm光径条件下，用生理盐水作为样品加入试剂时，试剂空白吸光度变化率（ΔA/min）应不大于0.002。 2.4 分析灵敏度 测定活性为200U/L样本时，吸光度变化率（ΔA/min）不小于0.012。 2.5 线性范围 测试血清样本，试剂线性在[25，750]U/L(37℃)区间内：线性相关系数（r）不小于0.990；在[25，100]U/L区间内线性绝对偏差应不超过±10U/L；（100，750]U/L区间内,线性相对偏差不超过±10%。 2.6 重复性 用质控样品重复测试所得结果的重复性（变异系数，CV）应不大于5%。 2.7 批间差 不同批号试剂测试同一份样本，测定结果的批间相对极差应不大于10%。 2.8 准确度 相对偏差：相对偏差应不超过±10%。 2.9 稳定性 效期稳定性：试剂盒在2℃~8℃下有效期为15个月。取失效期的试剂盒进行检验，试验结果满足2.3、2.4、2.5、2.6、2.8的要求。
植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC3125 规格:100T/48S 产品内容： 试剂一：粉剂×2瓶。使用前加少量水溶解，定容至50mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）。 试剂二：液体100mL×2瓶，4℃保存。 试剂三：乙酸乙酯，自备。 产品说明： 生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase,PDHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。 受氢体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲替（TriphenylFormazone，即TFF）呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得植物脱氢酶活性。 试验中所需的仪器和试剂： 台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水、乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。 操作步骤： 一、样品处理： 称取0.1g的植物组织，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，备用。 二、测定步骤： 1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，乙酸乙酯调零。 2、操作表：取5mLEP管依次加入
对照管测定管 样品（g）0.10.1 试剂一（mL）1 试剂二（mL）21 充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，去滤液，尽量用滤纸吸干样品，置于研钵/匀浆器中。 试剂三（mL）11 充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三定容至2mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取200μL上清至微量 玻璃比色皿或96孔板中，测定485nm下的吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。 三、脱氢酶活力计算 A:用微量玻璃比色皿（光径，1cm）测定的计算公式如下 酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.01为一个酶活单位。 脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.01÷T÷W=33×ΔA÷W。 B:用96孔板（光径，0.5cm）测定的计算公式如下 酶活单位定义：在37℃时，每小时每克组织样品使反应体系吸光值每增加0.005为一个酶活单位。 脱氢酶活性（U/g/h）=ΔA÷0.005÷T÷W=66.7×ΔA÷W。 T：反应时间，3h；W：样品鲜重，g。 注意事项： 1.配制好的试剂一避光保存于4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。 2.试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。 3.反应完成后立即冰浴以终止反应，并去除干净残留的反应液。 4.如果测定出来的吸光值较大，需把样品适当稀释再进行测定，注意计算公式乘以稀释倍数。 5.如果用96孔板进行检测，建议不要使用聚苯乙烯/聚丙烯材质的96孔板。
谷氨酸脱氢酶测定试剂盒（α-酮戊二酸底物法） 适用范围：用于体外定量测定人血清或血浆中谷氨酸脱氢酶的含量。 1.1 包装规格 包装规格见表1。 表1 包装规格
1.2 主要组成成分
主要组成成分见表2。 表2 主要组成成分 注：不同批号的校准品、质控品赋值有差异，具体赋值详见靶值单。 2. 性能指标
2.1 外观 试剂1为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂2为无色或淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 校准品为黄色粉末状物质，复溶后为淡黄色或黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 质控品为黄色粉末状物质，复溶后为淡黄色或黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。 2.2 净含量 试剂的净含量应不少于标称量。 2.3 试剂空白 2.3.1 试剂空白吸光度 A340nm下测定空白吸光度应≥ 0.8000。 2.3.2 试剂空白吸光度变化率 A340nm下测定的空白吸光度变化率（ΔA/min）应≤ 0.0200。 2.4 准确度 与已上市产品进行比对试验：在[1，120] U/L区间内，相关系数r≥0.975，在[1，20] U/L区间内测定的绝对偏差应不超过±2U/L，在（20，120] U/L区间内测定的相对偏差应不超过±10%。 2.5 分析灵敏度 样本浓度为30 U/L时，其吸光度变化率在0.0050～0.0300之间。 2.6 线性区间
在[1，120] U/L区间内，线性相关系数r≥0.990，在[1，20]U/L区间内绝对偏差应不超过±2 U/L，在（20，120] U/L区间内相对偏差应不超过±10%。 2.7 测量精密度 2.7.1 重复性 对高、低浓度的血清样本或质控品重复测定10次，其测定值的变异系数（CV％）应不大于10％。 2.7.2 批间差 随机抽取三批试剂盒的批间相对极差（R）应不大于10%。 2.8 瓶间精密度 校准品、质控品的瓶间精密度应≤10%。 2.9 稳定性 2.9.1 试剂稳定性 试剂盒在2℃～8℃密封避光保存，有效期为18个月。在试剂盒有效期满后一个月以内，应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7.1的要求。 2.9.2 校准品复溶稳定性 复溶后校准品在2℃～8℃保存7天，在生化分析仪上同时测试保存期末的校准品和新鲜的校准品，测试结果间的相对偏差应≤10%。 2.9.3 质控品复溶稳定性 复溶后质控品在2℃～8℃保存7天，在生化分析仪上同时测试保存期末的质控品和新鲜的质控品，测试结果间的相对偏差应≤10%。 2.10校准品溯源性
血清谷氨酸脱氢酶活力检测在肝胆疾病中的临床价值（摘要） 赵元明刘凌云 （济宁医学院附属医院检验科山东济宁 272029）谷氨酸脱氢酶(GLDH)为一种含锌线粒体酶，主要分布于肝脏、心肌和肾细胞线粒体的基质及内膜中,而以肝组织活性最高[1]。分布于肝细胞线粒体内的GLDH在肝细胞受损害时会明显升高[2]。天门冬氨酸氨基转移酶(AST)则主要存在于心、肝和骨骼肌中，其中肝中的AST 大部分存在于线粒体中，所以AST的检测也可作为肝细胞损害的辅助性指标[3]。本文利用全自动生化分析仪测定各种肝病患者GLDH、AST和ALT活性，并与健康体检者比较，以分析评价其临床应用价值。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂仪器：日立7600-120全自动生化分析仪；试剂：GLDH试剂为罗氏公司提供，AST、ALT试剂均为德国CENTRONIC，质控品为英国RANDOX公司提供。并采用试剂公司推荐的参数进行相关测定。 1.2研究对象健康对照组为73例，为2011年1月-8月期间在我院做健康体检的人群，各种理化指标均正常，并且排除心、脑、骨、肾及肝胆等系统的疾病。肝细胞损伤疾病组109例，均以临床症状结合血清病毒学标志及其他临床辅助综合判断的患者，其中急性肝炎12、肝癌28例、肝硬化13例、胆道肿瘤14例、胆结石17例、其它肝胆疾病15例(包括肝脓肿、胆结石及胆囊炎等)，亦为同期在我院住院的患者。所测标本均合格。 1.3测定方法 GLDH、AST和ALT测定均采用酶速率法，并分别采用低、中、高值进行精密度检测，严格按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。 1.4统计学处理计量数据以均数±标准差
血清乳酸脱氢酶同工酶测定 （醋酸纤维素薄膜电泳法） [原理] 先将血清在醋酸纤维素薄膜进行电泳使乳酸脱氢酶的同工酶分离，然后在薄膜上进行酶反应，显色试剂中包括有底物（乳酸）、NAD+、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）和碘硝基四唑蓝（INT），NAD+和PMS起递氢作用，INT最后接受氢被还原生成紫色的甲臜类化合物。其反应如下： LD 乳酸+NAD+丙酮酸+NADH2 NADH2+PMS NAD++PMSH2 PMSH2 +INT PMS+INTH2 [试剂] 1．PH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，溶于热的蒸馏水中，冷后加蒸馏水至1L。 2．0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钾2.16g，磷酸氢二钠 （Na2 HPO4.2H2O）30.13g, 溶于蒸馏水中，并稀释至1L。 3．0.5mol/L乳酸钠溶液：吸取60%DL—乳酸钠溶液9.25ml,加蒸馏水至100ml。 4．显色试剂：临用前配制下列试剂： （1）1mg/ml吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）水溶液； （2）辅酶Ⅰ（NAD+）10mg，溶于pH7.5磷酸缓冲液1ml； （3）碘硝基四唑蓝[氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑]（INT）12mg，溶于pH7.5磷酸缓冲液3ml中； （4）0.5 mol/L乳酸钠溶液1ml。 其中（2）、（3）、（4）混合后为甲液，（1）为乙液；用时以甲液∶乙液=20∶1混合。应用前，将上述溶液充分混和；但PMS水溶液加入量为0.2ml，且应待其他三种溶液混和后再加。 4．洗脱液：正丙醇9份与二甲亚砜1份混匀即可。
乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 货号：BC1080 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。临用前把试剂二转移到试剂一中，分装保存于-20℃。 试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体5mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： ADH是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH释放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否异常。 ADH催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm处有吸收峰，而NAD+没有；测定340nm吸光度下降速率，来计算ADH活性。 自备仪器和用品： 研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提 取液）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。 2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞 加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待测。 3、血清等液体：直接测定。 二、ADH测定操作：
1.分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2.试剂一在25℃水浴中保温30min以上。 3.空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于 340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2。△A空白管=A1-A2。空白管只需做1~2个。 4.测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于 340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A3和A4。△A测定管=A3-A4。 三、ADH活性计算： （1）按照蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/mg prot)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(Cpr×V样)÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管)÷Cpr （2）按照样本质量计算 活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/g)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(W×V样÷V样总)÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管)÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmolNADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/104cell)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管)÷细胞数量 （4）按液体体积计算 活性单位定义：25℃中每毫升样品每分钟氧化1μmol NADH为1个酶活单位。 ADH(μmol/min/mL)=[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷V样÷T =1.61×(△A测定管–△A空白管) ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；
GLDH检测方法 (Glutamate Dehydrogenase) SDZ500140 1. 目的 本程序是为了建立谷氨酸脱氢酶（Glutamate Dehydrogenase）的活性检测方法，适用于GLDH成品的活性检测。 2. 检测 2.1原理 α-Ketoglutarate + NH3 + NADH + H+L-Glutamate+ NAD+ +H2O NADH的消耗可以通过340nm的光吸收进行检测。 2.2试剂： A 0.1 M Tris-HCl 缓冲液, pH 8.3 B 1.5M NH4Cl溶液 C 0.225M α-酮戊二酸溶液(pH 7.0-9.0) D 7.5mM NADH溶液 E 酶稀释液: 0.1 M Tris-HCl 缓冲液, pH 8.3 试剂的配制方法详见各试剂配制记录,配制人员需完整填写配制记录。 3 操作规程： 3.1仪器参数设定 若仪器中无已保存参数，按以下参数设定。若已有相关参数，调取后确认。 检测方法：动力学扫描 测量波长：340nm 测量时间：180s 延迟时间：60s 积分时间：120s 系数/因子：6.776 测量温度：30±1℃ 3.2 样品准备 若待测样品为固体，可以按10mg 样品/1000ul 超纯水比例溶解。溶解后于2-8度放置30min。 3.3 检测方法 3.3.1 在石英比色皿中加入2.5ml 试剂A, 200ul试剂B,100ul 试剂C, 100ul D于30度孵育 2min。 3.3.2 加入50ul 样品后, 温和混匀后开始测定。 3.3.3 测定结束后，记录相应数值：起始读数、△A/min test、活性值（U/ml）。 3.3.4 活性值（U/ml）范围为0.1-0.3U/ml，若超出范围，待测样品需经试剂D稀释后再 次进行检测。 3.3.5测定样品前需检测空白反应值，即其他操作不变，用500ul E代替样品加入比色皿后 进行反应,测定△A/min blank。 3.3.6计算公式活性(U/ml) =(△A/min test-△A/min blank)×6.776×df （稀释倍数）
乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC0755 规格：100T/96S 产品内容： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂40mg×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入3mL蒸馏水溶解，-20℃分装保存；或者按比例现用现配。 试剂三：液体0.5mL×1支，4℃避光保存。 试剂四：液体1mL×1支，4℃保存。 试剂五：液体2mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶I 的存在下，它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内，线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。 乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD+转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min。 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定步骤： 1、紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。 3、操作表： 试剂名称空白管测定管 样本（μL）40 蒸馏水（μL）10060 试剂一（μL）6060 试剂二（μL）2020 试剂三（μL）44 试剂四（μL）66 试剂五（μL）1010 在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱1min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定90s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、ALDH酶活计算 1、按微量石英比色皿计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。 ALDH酶活（U/mg prot）=△A÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Crp）÷T=804×△A÷Cpr （2）按样本质量计算
第26卷第1期2004年3月 大连医科大学学报 Journal of Dalian Medical University Vol.26No.1 Mar.2004 血清谷氨酸脱氢酶的检测及对肝病诊断的临床应用 肖晓光1,孙国华1,王 华2 (1.大连医科大学第一临床学院检验科,辽宁大连 116011;2.大连医科大学检验医学院,辽宁大连 116027) 摘要:[目的]通过观察血清中谷氨酸脱氢酶(GLDH)在肝细胞损害性疾病中酶活性的变化情况,来指导临床治疗,并对预后进行判断。[方法]采用德国临床化学学会推荐的α-酮戊二酸法检测谷氨酸脱氢酶,同时检测AST、ALT、TBA及γ-GT等常规生化项目,并作相关性分析,统计有关指标。[结果]对于肝细胞损伤性疾病患者,血清中谷氨酸脱氢酶的活性明显高于健康者和其他疾病患者(P<0.05)。其中急性坏死性肝病患者GLDH阳性率可达100%,急性病毒性肝炎为75.2%,慢性活动性肝炎为59.4%,酒精性肝硬化为66.2%,肝硬化为66%,原发性肝癌为42.1%。[结论]谷氨酸脱氢酶作为肝细胞病变,特别是急性缺血性肝炎和酒精性肝炎的诊断指标 具有重要临床价值,并对指导临床治疗和预后判定具有重要意义。 关键词:谷氨酸脱氢酶;肝损伤;临床应用 中图分类号:R446.1 文献标识码:B 文章编号:1671-7295(2004)01-0048-03 谷氨酸脱氢酶(GLDH)为一种含锌线粒体酶,主要分布于肝脏、心肌和肾细胞线粒体的基质及内膜中,而以肝组织活性最高[1]。它催化谷氨酸脱氢、脱氨最终生成α-酮戊二酸之间的可逆反应[2]。此反应是体内大多数氨基酸经脱氢联脱氨基的关键步骤,也是体内非必需氨基酸由联合脱氨逆向反应生成的重要反应,还是连接氨基酸代谢,三羧酸循环的中心环节,故主要分布于肝细胞线粒体内的GLDH只有在肝细胞受损害时才明显升高[3]。本文利用生化自动分析仪测定了各种肝病患者,相关心、肾等疾病及健康体检者的G LDH活性,并与常规肝功能指标对比,以分析评价其临床应用意义。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 原理:α-酮戊二酸+NADH+NH4+GLDH 谷氨酸+NAD++H2O。在上述反应中,NADH被氧化生成NAD+的速率与GLDH的活性呈正比。在340nm波长下测定NADH的下降速率,即可计算出GLDH的活性。 1.1.2 研究对象:健康对照组为60例各项理化指标正常的体检者。疾病组218例,系大连医科大学第一临床学院各科确诊的住院病人。其中急性缺血性肝炎20例,急性病毒性肝炎25例,慢性活动性肝炎32例,酒精性肝炎12例,肝硬化48例,原发性肝癌24例,胆系疾病15例,脑出血10例,心肌梗塞20例,肾衰12例。 1.1.3 仪器:日立7170S型生化自动分析仪。 1.1.4 试剂:北京世诊中拓生物技术有限公司生产R1(三乙醇胺缓冲液、醋酸铵、EDTA);R1a (ADP、NADH、LD);R2(α-酮戊二酸)。以R1复溶后的R1a与R26:0.24混合作为工作试剂。 1.2 方法 1.2.1 德国临床化学学会推荐优化标准法:血清样品20μL,混合工作试剂250μL,温度37℃,波长340nm,反应时间4min;同时采用临床常规方法测定血清AST、ALT、TBA、γ-GT。 1.2.2 统计方法:单侧95%水平确定参考值范围,进行t检验及相关性分析。 作者简介:肖晓光(1971-),女,大连人,主管检验师。收稿日期:2002-11-21;修回日期:2002-12-10。
微生物学通报 MAR 20, 2011, 38(3): 388?395 Microbiology China ? 2011 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.doczj.com/doc/b49234152.html, 基金项目：国家自然科学基金项目(No. 31070039, 51073081); 天津市科技支撑重点项目(No. 09ZCKFSH00800) *通讯作者：Tel: 86-22-23503866; : songcj@https://www.doczj.com/doc/b49234152.html, 收稿日期：2010-07-14; 接受日期：2010-11-19 摘 要: γ-聚谷氨酸是一种具有极强水溶性、生物相容性、可完全降解性的环境友好型新材料。介绍γ-聚谷氨酸的基本性质、微生物合成及其影响因素, 综述其合成相关基因、合成酶复合体的研究进展及在水凝胶和药物载体方面的应用前景。 关键词: γ-聚谷氨酸, 生物合成, 合成酶基因, 应用前景 Biosynthesis of poly (γ-glutamic acid), its related genes and application prospects CAO Ming-Feng 1 JIN Ying-Hong 1,2 XIE Hui 1 WANG Shu-Fang 2 SONG Cun-Jiang 1,2* (1. Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology , Ministry of Education , Department of Microbiology , Nankai University , Tianjin 300071, China ) (2. Key Laboratory of Bioactive Materials , Ministry of Education , Nankai University , Tianjin 300071, China ) Abstract: Poly (γ-glutamic acid) is a promising environmental friendly material with outstanding water solubility, biocompatibility and degradability. This review introduces the basal properties of γ-PGA, microbial production of γ-PGA, and the key factors affecting the yield of γ-PGA. Furthermore, the γ-PGA biosynthesis genes, γ-PGA synthetase complex, as well as the application prospects of γ-PGA in hydrogel and drug delivery, are also discussed. Keywords: Poly (γ-glutamic acid), Biosynthesis, Synthetase genes, Application prospects γ-聚谷氨酸[Poly (γ-glutamic acid), γ-PGA]是由D-/L-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合而成的一种高分子阴离子多肽型聚合物。结构式见图1。生物合成的γ-聚谷氨酸通常由500?5 000个谷氨酸单体组成, 分子量为10 kD ?10 000 kD, 立体构型分为γ-聚D-谷氨酸(γ-D-PGA)、γ-聚L-谷氨酸(γ-L-PGA)和γ-聚
土壤脱氢酶活性的测定 一、实验原理 脱氢酶的正式命名是AH：B氧化还原酶，广泛存在于动植物组织和微生物细胞内，它能酶促一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对土壤中有机物的氧化分解能力，即土壤酶的活性。 已知受氢体可接受脱氢酶脱出的氢原子，根据接收氢原子的量可以判断脱氢酶的活性。如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，俗称红四唑）接受氢后变成红色的三苯基甲瓒（TF），根据产生红色的色度进行比色定量分析，就可以判断脱氢酶的活性。通常，吸光度越大（红色越深），脱氢酶活性越大。 二、实验材料、试剂和仪器 1．材料：过0.9mm孔径筛的土壤样品，8g 2．试剂：0.36%Na2SO3溶液，15ml Tris-HCl缓冲液（PH=7.6），45ml 0.4%TTC,7.6ml Na2S2O4，十几粒 甲醛，10ml 丙酮，20ml 3．仪器：50ml具塞比色管，6只 比色管架，1只 1~5ml移液枪，1只（枪头3个） 100~1000ul移液枪1只（枪头1个） 药匙1个 水浴锅1个 分光光度计1台 分析天平1台 离心管4只 培养箱1台
离心机1台 三、实验步骤 1．标准曲线的绘制 （1）按下表配制系列浓度的TTC标准溶液。 （2）显色。 用药匙向每只比色管中各加入少许连二亚硫酸钠（Na2S2O4），混匀，使TTC 全部还原为红色的TF。用1~5ml移液枪向各管滴加1ml甲醛终止反应，摇匀后再加入2ml丙酮震荡摇匀，37℃水浴10min。 （3）测定吸光度，绘制标准曲线。 在485nm波长下测定各管溶液的吸光度A，并以A为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。 2．土壤脱氢酶活性的测定 （1）培养并显色（此步骤由助教预先完成）。 首先，按下表向四只离心管中分别加入以下物质 然后，将以上四只离心管避光，37℃保温培养12~24h。 （2）培养结束后，用1~5ml可调式移液枪向各管分别加入1ml甲醛终止反应，
人谷氨酸脱氢酶(GDH)酶联免疫分析 （ELISA）试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中人谷氨酸脱氢酶(GDH) 含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人谷氨酸脱氢酶(GDH)水平。用纯化的人谷氨酸脱氢酶(GDH)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入谷氨酸脱氢酶(GDH)，再与HRP 标记的谷氨酸脱氢酶(GDH)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷氨酸脱氢酶(GDH)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人谷氨酸脱氢酶(GDH)浓度。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20 分钟，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右
微生物发酵产聚谷氨酸工艺研究 摘要：谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。以枯草芽孢杆菌纳豆亚种为出发菌株，考察不同碳氮源及NaCl 浓度、谷氨酸、种龄、接种量对微生物发酵产γ- 聚谷氨酸的影响，以提高γ- 聚谷氨酸的产量。方法：该菌菌种活化后，接入种子培养基，于37℃、200 r/min 震荡培养18 h，然后按2 %接种量接入不同发酵培养基进行发酵培养。γ- 聚谷氨酸分离纯化后，根据其产量筛选最适发酵培养基组成及发酵条件，并对产物进行分析测定。 关键词：γ- 聚谷氨酸；纳豆菌；发酵；优化培养 一、材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto），系作者筛选，由本校微生物教研室罗兵教授鉴定确认，于实验室保存。 1.1.2 培养基斜面培养基：大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 7.5 g/L，琼脂20 g/L。种子培养基：大豆蛋白胨20 g/L，葡萄糖30 g/L，谷氨酸钠25 g/L，NaCl 5 g/L。液体发酵培养基：大豆蛋白胨30 g/L，葡萄糖40 g/L，谷氨酸钠30 g/L，NaCl15 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，KH2PO4 4.0 g/L，Mg-SO4 0.5 g/L，CaCl2 0.25 g/L 及少量生物素[1]。以上培养基pH 均为7.0-7.2，在121℃下高压灭菌20 min。 1.1.3 试剂γ-PGA 标准品为Sigma 公司产品；系列葡聚糖标准品（Shodex P-82 standard 标准品，分子量（Mr）分别为5900，11800，22800，47300，112000，212000，404000，788000）为SHOWA DENKO 公司产品；叠氮钠、硫酸钠、蛋白胨、葡萄糖、谷氨酸等均为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 发酵方法菌种活化：取菌种一环，接于斜面培养基，37℃培养20 h。 种子培养：取一至两环活化菌种接入种子培养基中，37℃、200 r/min 震荡培养18 h。 发酵培养：将上述种子液按2%接种量接入发酵培养基（装液量为40/250 mL），37 ℃、250 r/min 震荡培养48 h，测γ-PGA 的产量。 1.2.2 提取方法发酵液于4 ℃、10000 r/min 离心15 min 去除菌体，取上清液用6 mol/L HCl 将pH 调至2.0-3.0，加入3 倍体积冰无水乙醇搅拌出现絮状沉淀，低温放置4 h 离心得沉淀（粗品）。然后溶于蒸馏水，用透析袋透析脱盐（除去无机小分子和离子），再经阴离子交换层析进一步提纯，即将透析过的
土壤脱氢酶（S-DHA）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0390 规格：50T/24S 产品简介： 土壤脱氢酶(Soil dehydrogenase,sDHA)的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，可以作为土壤微生物的降解性能指标。 氢受体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride,TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，被还原为三苯基甲臜（Triphenyl Formazone,TF），TF呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得土壤脱氢酶活性。 试验中所需的仪器和试剂： 筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计、玻璃比色皿，冰、蒸馏水、丙酮（不允许快递，请用户自备）。 产品内容： 试剂一：粉剂×1瓶，使用前加30ml水溶解，4℃避光保存（尽量现配现用）。 试剂二：液体50ml×1瓶，4℃保存。 试剂三：丙酮，自备。 操作步骤： 一、样本前处理： 1.土壤样品：准确称取过40目筛的新鲜土壤样品约0.1g（以保证TTC与土壤颗粒充分接触）。 2.污泥样品：污泥用蒸馏水洗涤，12000rpm，25℃，离心10min，弃上清，反复3-4次。 二、测定操作： 对照管测定管 样品（g）0.10.1
试剂一（ml） 0.5试剂二（ml）10.5 充分混匀，37℃，暗培养6h，取出后立即冰浴5min 试剂三（ml）0.50.5 反复震荡数次，37℃保温10min，12000rpm，4℃，离心5min，取上清1ml 于1ml 玻璃比色皿， 分光光度计提前30分钟预热，蒸馏水调零，测定对照管和测定管，计算△A。 脱氢酶活力的计算： 酶活单位定义：在37℃时，每克样品每小时使每ml 反应体系OD 值每增加0.01为一个酶活单位。计算公式：sDHA 活性（U/g）=01.0△A ÷培养时间（6h）÷样品质量（0.1g）×V 反总（1.5ml） =250×A 485 注意事项： 1. 配制好的试剂一避光保存于4℃，最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。2. 试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。3. 反应完成后立即冰浴以终止反应。4. 如果测定出来的吸光值较大，减少样品用量再进行测定，若吸光值过小则延长培养时间。5.试剂盒2-8℃保存。