凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤
凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化技术，可用于分离和富集目标蛋白。其原理是利用凝胶材料的孔隙大小和蛋白分子的大小差异，通过层析柱中的凝胶层对混合蛋白进行分离。这种方法操作简单，效果稳定，是许多实验室常用的蛋白纯化方法之一。
下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤：
1. 准备工作
在开始实验之前，首先需要准备层析柱和凝胶。层析柱可以使用预填充的封闭柱，也可以自己制备。常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶（PAA）和琼脂糖凝胶。根据实验需求和目标蛋白的分子量，选择合适的凝胶孔隙大小。
2. 样品的制备
将待纯化的蛋白样品制备好。通常需要将样品溶解于缓冲液中，并添加一定的抑制剂，以防止蛋白的降解和活性丢失。在制备样品时，可以根据需要对蛋白进行特定的标记或修饰。
3. 样品的加载
将制备好的蛋白样品加载到层析柱上。可以使用注射器或微量移液器将样品缓慢地滴加到层析柱顶部。为了保证样品的均匀加载，可以在样品前后添加一定量的缓冲液。
4. 蛋白的分离
一旦样品加载完毕，蛋白分子将开始在凝胶层中进行分离。较小的蛋白分子能够进入凝胶孔隙，而较大的蛋白分子则无法进入，从而实现了蛋白的分离。分离过程中，可以通过重力流动或离心力来推动样品通过层析柱。
5. 洗脱纯化蛋白
待纯化的蛋白通常会与凝胶层中的其他成分发生相互作用，如亲和作用或静电作用。为了洗脱纯化的蛋白，可以使用适当的洗脱缓冲液。洗脱缓冲液中的成分可以改变蛋白与凝胶层之间的相互作用，使蛋白从凝胶中解离出来。
6. 收集纯化蛋白
洗脱后的蛋白溶液即为纯化蛋白，可以通过收集溶液进行后续的实验或分析。为了保证蛋白的完整性和活性，收集的溶液应该尽快进行保存或下一步实验。
总结：
凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过凝胶层的孔隙大小与蛋白分子的大小来实现蛋白的分离。其步骤包括准备工作、样品制备、样品加载、蛋白分离、洗脱纯化蛋白和收集纯化蛋白。这种方法操作简单，适用于不同分子量的蛋白纯化，是许多实验室常用的技术之一。在实验过程中，需要注意样品的制备和加载，以及选择合适的凝胶材料和洗脱缓冲液。通过凝胶过滤层析，可以得到高
纯度的蛋白样品，为后续的实验和分析提供了可靠的基础。
蛋白纯化步骤 引言： 蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。 一、细胞裂解和收集 蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。 二、沉淀和上清液分离 细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。 三、蛋白质分子量筛选 蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。
四、亲和纯化 亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。 五、离子交换层析 离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。 六、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。 七、逆流层析 逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 K av是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的K av=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的K av=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤K av﹤1，在中间位置被洗脱。可见，K av 的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因K av值不同而被分离。 三、仪器与试剂 1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 （1）标准蛋白 a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤 凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化技术，可用于分离和富集目标蛋白。其原理是利用凝胶材料的孔隙大小和蛋白分子的大小差异，通过层析柱中的凝胶层对混合蛋白进行分离。这种方法操作简单，效果稳定，是许多实验室常用的蛋白纯化方法之一。 下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤： 1. 准备工作 在开始实验之前，首先需要准备层析柱和凝胶。层析柱可以使用预填充的封闭柱，也可以自己制备。常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶（PAA）和琼脂糖凝胶。根据实验需求和目标蛋白的分子量，选择合适的凝胶孔隙大小。 2. 样品的制备 将待纯化的蛋白样品制备好。通常需要将样品溶解于缓冲液中，并添加一定的抑制剂，以防止蛋白的降解和活性丢失。在制备样品时，可以根据需要对蛋白进行特定的标记或修饰。 3. 样品的加载 将制备好的蛋白样品加载到层析柱上。可以使用注射器或微量移液器将样品缓慢地滴加到层析柱顶部。为了保证样品的均匀加载，可以在样品前后添加一定量的缓冲液。
4. 蛋白的分离 一旦样品加载完毕，蛋白分子将开始在凝胶层中进行分离。较小的蛋白分子能够进入凝胶孔隙，而较大的蛋白分子则无法进入，从而实现了蛋白的分离。分离过程中，可以通过重力流动或离心力来推动样品通过层析柱。 5. 洗脱纯化蛋白 待纯化的蛋白通常会与凝胶层中的其他成分发生相互作用，如亲和作用或静电作用。为了洗脱纯化的蛋白，可以使用适当的洗脱缓冲液。洗脱缓冲液中的成分可以改变蛋白与凝胶层之间的相互作用，使蛋白从凝胶中解离出来。 6. 收集纯化蛋白 洗脱后的蛋白溶液即为纯化蛋白，可以通过收集溶液进行后续的实验或分析。为了保证蛋白的完整性和活性，收集的溶液应该尽快进行保存或下一步实验。 总结： 凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过凝胶层的孔隙大小与蛋白分子的大小来实现蛋白的分离。其步骤包括准备工作、样品制备、样品加载、蛋白分离、洗脱纯化蛋白和收集纯化蛋白。这种方法操作简单，适用于不同分子量的蛋白纯化，是许多实验室常用的技术之一。在实验过程中，需要注意样品的制备和加载，以及选择合适的凝胶材料和洗脱缓冲液。通过凝胶过滤层析，可以得到高
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程 引言： 蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。 一、凝胶过滤层析的原理 凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。该方法利用特定的凝胶材料，通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中，较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部，而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。通过这种方式，可以实现对蛋白的分离和纯化。 二、凝胶过滤层析的步骤 1. 准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。 2. 杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。 3. 样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。 4. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。 5. 收集纯化蛋白：将目标蛋白收集，可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。
三、凝胶过滤层析的优势和应用 凝胶过滤层析具有以下优势： 1. 无需特殊设备：相较于其他蛋白纯化方法，凝胶过滤层析不需要昂贵的设备，操作简单方便。 2. 高分辨率：凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离，得到高纯度的目标蛋白。 3. 适用范围广：凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白，包括酶、抗体、细胞因子等。 凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下方面：1. 蛋白纯化：凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一，可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。 2. 质量控制：凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度，对蛋白质的质量进行评估。 3. 蛋白互作研究：凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子（如核酸或小分子化合物）的相互作用。 4. 蛋白结构分析：凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。 结论： 凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。该方法在生物学研究中有广泛的应用，可以用于蛋白纯化、质量控制、蛋白互作研究和蛋
蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序 蛋白质凝胶层析是一种常用的蛋白质分离纯化技术，其原理是利用凝胶层析柱中的凝胶颗粒与蛋白质之间的物理化学互作用实现蛋白质的分离和纯化。在蛋白质凝胶层析中，洗脱顺序是非常重要的，不同的洗脱顺序会对分离和纯化的效果产生明显的影响。下面将详细介绍几种常用的蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序。 一、离子交换层析 离子交换层析是一种利用离子交换树脂分离和纯化蛋白质的方法。在离子交换层析中，蛋白质与树脂之间的相互作用是通过蛋白质和树脂之间的电荷相互吸引而实现的。树脂表面带有固定电荷，蛋白质通常具有正电荷或负电荷，因此它们可以相互吸附在树脂上。洗脱时，通常采用逐渐增加或减少盐浓度的方法，通过改变离子强度来控制蛋白质的吸附与解吸，实现蛋白质的分离和纯化。 离子交换层析的洗脱顺序通常分为以下几步： 1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在树脂上的亲和物质和非特异性吸附物。 2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如组织碎片、细胞碎片和核酸等。 3. 分级洗脱：从低盐到高盐逐渐增加缓冲液中的离子浓度，根
据蛋白质的亲和性和亲和强度，逐渐洗脱目标蛋白质。 4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱树脂上的杂质和非特异性吸附物。 5. 平衡：用平衡缓冲液平衡层析柱，使其恢复初始的交换能力。 二、尺寸排阻层析 尺寸排阻层析是一种根据蛋白质的大小差异来分离和纯化蛋白质的方法。在尺寸排阻层析中，凝胶层析柱中的凝胶颗粒具有固定的孔径，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。因此，大分子蛋白质会流经凝胶颗粒，而小分子蛋白质会进入凝胶颗粒内部，实现二者的分离。 尺寸排阻层析的洗脱顺序通常分为以下几步： 1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在凝胶颗粒表面的亲和物质和非特异性吸附物。 2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如细胞碎片、核酸等。 3. 分级洗脱：从大孔径到小孔径逐渐减少缓冲液中的孔径，根据蛋白质的大小差异，逐渐洗脱目标蛋白质。 4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱凝
【实验目的】 掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法 【实验原理】 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵 2、试剂：SephadexG-25 【实验步骤】 （1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。 （2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。 （3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。 （4）凝胶的预处理： 将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。多洗几次，尽量洗干净。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。充分溶胀后，进行真空脱气。 （5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。 （6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。 （7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。 （8）上样：上样量在5%~10%。 （9）标准曲线的制作： 本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。得到理想的出峰情况后，根据出峰时间与分子量大小作出标准曲线，得到曲线方程。 （10）样品分子量的确定： 在与标准品层析的相同条件下上样，对样品进行凝胶过滤层析。从层析图上得到出峰时间，然后根据标准曲线方程便可以计算得到对应的分子质量。
凝胶过滤层析的基本操作 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分 离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。该方法基于分子的大 小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通 过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。 1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适 合进行层析的条件。这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。 2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。 3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。通常用适当的缓冲液（如甘氨酸 盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。 4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续 地将样品滴入柱顶端。加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是 渗漏到填充物外。 5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。较小的分子 会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较 大的分子则会在填充物中逐渐滞留。洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。 6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。
7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。 凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。因此，在选择层析纯化方法时需要根据实际情况综合考虑。
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 操作人：XXX 时间：XXXX 地点：XXXX 温度：20℃ 实验目的： ①理解凝胶过滤层析的原理。 ②掌握装柱、平衡、上样、柱效检验的方法。 ③学会分析洗脱峰峰型。 试验方法与过程： 1.装柱 ①固定层析柱，柱内装1/2双蒸水，双蒸水下降到1/4时，关闭出口。 ②搅拌凝胶浆液，用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱，打开出口，让凝胶沉降。 ③装至柱内有2/3凝胶，上层保留至少0.5cm的水。 2.平衡 双蒸水平衡柱，管口上接恒流泵、下管接检测仪入口，控制流速。观察紫外检测仪平衡后A280应小于0.01.然后调整流速为2ml/min，暂停恒流泵。 3.加样 吸取5%丙酮溶液500ul，沿柱壁缓慢加入，控制出水口管的高度使使样品缓缓进入胶内，用1ml双蒸水冲洗壁上的样品，在加入3-4ml双蒸水后关闭盖子。 4.洗脱凝集 打开恒流泵开关，监视紫外检测仪的情况，待丙酮全部流出后加入，加入蛋白质混合物，监视紫外检测仪情况，开始出现上升即开始收集流出液。 蛋白质样品全部流出后，用双蒸水冲洗凝胶。 原始数据：
图一：从左到右第一个峰为丙酮，第二第三个峰分别为混合物中的两种蛋白质。 结果处理与分析： ①根据图像得As略大于1，说明装柱压力不足，可能滤网内有空气进入。 ②由于是先加入丙酮再打开色谱分析软件，所以不能分析到分配系数Kd。 ③在图一黑色箭头所指处色谱曲线出现了抖动，可能是因为在丙酮洗脱过程中打开了层析柱上口，导致空气进入。 ④加入样品后出现两个峰，说明混合样品中有两种大小不同的物质被分离出来。 讨论： 1.注意事项：一定要保证凝胶柱上层有液体覆盖，不能使之暴露于空气中；保证所灌凝胶中没有气泡，当有气泡和凝胶有明显分层时3，应在灌胶过程中及时用玻璃棒搅拌去除气泡及使不均匀的凝胶重悬后重新沉淀。 2.经验和心得：用滴管向凝胶柱内加入双蒸水和样品时，一定要沿管壁边旋转边缓慢加入，防止加入时产生压力太大，使凝胶柱上表面不平整；用滴管比用移液枪加样品好，因为滴管产生的压力小。 3.思考题： ①凝胶过滤层析柱的柱效与层析柱内凝胶的均匀程度，凝胶颗粒的完整程度有关。 ②实验中易出现的问题：凝胶柱上层双蒸水流干；加入样品破坏凝胶柱表面平整。
凝胶过滤层析步骤 凝胶过滤层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于生物分离和分析领域。下面将介绍凝胶过滤层析的步骤。 一、样品制备 在进行凝胶过滤层析之前，首先需要准备样品。样品可以是生物大分子，如蛋白质、核酸等。样品需要在适当的缓冲液中溶解，并进行必要的预处理，如去除杂质、浓缩等。 二、凝胶选择 凝胶过滤层析中常用的凝胶材料有几种，如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。在选择凝胶时，需要考虑样品的分子大小、分子量范围以及分离的目的等因素。不同的凝胶材料具有不同的孔隙结构和分子筛效果，因此需要根据实验要求选择合适的凝胶。 三、制备凝胶柱 凝胶过滤层析通常需要制备凝胶柱。制备凝胶柱的方法有很多种，常见的有手工制备和使用专用的凝胶柱填充器。制备凝胶柱时需要注意填充均匀、不产生气泡和空隙等问题。 四、样品加载 将制备好的样品加载到凝胶柱中。加载样品时，需要根据样品的性质和目的选择合适的操作方法。一般来说，可以采用重力或压力驱
动的方式进行样品加载。 五、洗脱和分离 完成样品加载后，可以进行洗脱和分离步骤。洗脱是指用适当的缓冲液将未结合的样品从凝胶中洗脱出来，以去除杂质。分离是指将目标分子从凝胶中洗脱出来，以实现分离纯化的目的。在洗脱和分离过程中，需要根据实验要求选择合适的缓冲液体系和洗脱条件。 六、收集和分析样品 完成洗脱和分离后，可以将洗脱液收集起来进行进一步的分析。收集的洗脱液可以用于测定目标分子的浓度、纯度以及其他相关性质。常用的分析方法有分光光度法、蛋白质浓度测定、电泳分析等。 七、凝胶再生 完成一次凝胶过滤层析后，凝胶柱需要进行再生以便下次使用。凝胶再生的方法有多种，常见的有使用盐溶液、酸碱溶液或特定的再生缓冲液进行再生。再生后的凝胶柱需要进行验证，确保再生效果良好。 总结： 凝胶过滤层析是一种简单有效的生物分离技术。通过选择合适的凝胶材料、制备凝胶柱、加载样品、洗脱和分离等步骤，可以实现对样品的纯化和分离。凝胶过滤层析在生物学、生物化学等领域有着广泛的应用，为研究和分析生物大分子提供了重要的手段。
凝胶过滤层析实验报告 凝胶过滤层析实验报告 引言： 凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富 集等领域。本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和 纯化，探究其原理和应用。 材料与方法： 1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。 2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。 3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。 4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。 实验步骤： 1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和 杂质。 2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。 3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。 4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。 结果与讨论： 通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分 离出不同大小的蛋白质。较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。这些蛋白质 可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。凝胶过滤层析方法具有许多优点。首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。 然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。首先，凝胶孔径的选择需要根据样品 的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全 分离。其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子 有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。 结论： 凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。本实验通过凝胶过滤层析的方法，成功分离了混合蛋白样品，并获得了纯 化后的蛋白质。凝胶过滤层析具有快速、简单和高效的特点，适用于多种样品 类型。然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性，需要根据实际情况进行选择和 优化。在今后的研究中，我们将进一步探索凝胶过滤层析的应用，并结合其他 技术手段，提高分离和纯化的效果。
实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 K av是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的K av=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的K av=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤K av﹤1，在中间位置被洗脱。可见，K av 的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因K av值不同而被分离。 三、仪器与试剂 1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 （1）标准蛋白 a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分 离范围较宽的凝胶，如用sephacryls-300。对于分子量在3~5kda的蛋白质，脱盐时应选 用sephadexg50或g25；而对于小分子量多肽物质（1~5kda），脱盐则应选用 sephadexg10或sephadexg15。 ②凝胶介质的处置和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶 胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时， 该法同时具有灭菌的作用。 凝胶过滤器层析柱的短与直径的比例应属50~100:1。装柱时柱体必须横向，先在柱内重新加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液 =3：1）烘烤光滑，缓慢并已连续地一次性转化成柱内。装柱过程中，必须防止柱内缓冲 液流干，特别注意维持柱体凝胶光滑无气泡和裂缝。出厂后，需用2ml蓝色葡聚糖溶液检 查柱体的光滑性。例如柱体光滑，可知蓝色区带光滑稳定地通过凝胶，不取任何条纹。必 须维持凝胶和缓冲液温度一致，以增加气泡的产生。③上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5%，如超过5%，则会导致分离效率降低，低于1%则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应 尽可能浓缩至10~20mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会 使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经0.2μm?孔径滤膜 过滤或10，000g离心5min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④洗脱 洗脱液应当维持一定的离子强度以消解凝胶中所含的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的 融合促进作用。sephadex和sepharosecl凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应属 0.02mol/l；sephacryl凝胶应属0.05mol/l。有时洗清溶液的离子强度甚至仅约0.2mol/l，以确保蛋白质不与凝胶介质融合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在1ml/min左右，低 流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。⑤分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤器层析中，拆分蛋白的监测和收集与色谱法层析相同。⑥层析柱的再造与留 存 洗脱完成后，继续用3-5个柱床体积缓冲液洗涤柱体，即可使凝胶再生。也可用 0.2mol/lnaoh或1mol/lnacl或非离子型去垢剂0.2~1%np-40去除吸附过紧的杂质，再用
凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（附凝胶过滤法原理及基本操作）-1 （一）原理 凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不 易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后 样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积 较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 （二）试剂与器材 （1）Sephadex G-25。 （2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。 （3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘11 0g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转 变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏 水至2000ml，混匀备用。 （4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。 （5）1.5cm×20cm层析柱。 （6）黑、白比色磁盘。 （三）操作 （1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0. 0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱， 打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降
高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.017 5mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱， 以平衡凝胶。 （2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢 浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液， 每管10滴。 （3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由 每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色 沉淀时，停止收集洗脱液。 （4）由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘 孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并 检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为“脱盐”后的IgG。 注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下 一管，以免造成相互污染假象。 附：凝胶过滤法原理及基本操作 1．原理 凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（g el osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种 层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到 分离的方法。
凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
凝胶过滤法分离蛋白质 一、实验目的 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 二、实验原理 凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。 三、试剂与仪器 0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血 1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒 四、实验步骤 1.凝胶溶胀 2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。 3.样品处理 4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。 5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色
的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。 6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。 五、实验现象结果及其讨论 颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。 原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。 2.红褐色慢慢变深，是因为分子的扩散有快有慢，少量的高铁血红蛋白与缓冲液一起滴出，使得溶液慢慢加深。 3.溶液变成深褐色，是过虑后，高铁血红蛋白的本色，颜色越深表明过虑后得到蛋白质越纯。 4.红褐色又开始变浅是因为大部分高铁蛋白已经洗脱下来，剩下少部分洗脱较慢的高铁蛋白，所以颜色又开始变浅。 5.开始呈现浅黄色，并又出现黄色，最后变成无色是因为高铁氰化钾的扩散快慢决定的，少部分扩散较快，接着大部分K3Fe(CN)6,洗脱出来，最后抗凝全血几乎洗脱完毕。试管接收的是缓冲液。 6.造成红褐色在前释出，接着才到黄色，其原因是：血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白，因为高铁血红蛋白的分子大，洗脱速度快而小分子的高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而造成红褐色在前洗脱出来，黄色在后。 六、思考题 1.利用凝胶层析后分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？
实验三凝胶过滤法分离蛋白质 【实验目的】 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 【基本原理】 凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。 当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。 凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。 在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。 【实验试剂、材料和器材】 （一）试剂 （1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）： 称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。 （2）0.4% K3Fe（CN）6： 称取0.4g K3Fe（CN）6，溶于100mL蒸馏水中。 （3）生理盐水：0.85~0.9%氯化钠水溶液，置于冰箱中预冷。 （4）四氯化碳（CCl4） （5）交联葡聚糖（Sephadex-G-25） （二）材料 动物的抗凝全血 （三）器材 pH计，1.5cm×20cm的层析柱，电子天平，冰箱，试管，容量瓶，量筒，大烧杯，玻璃棒，胶头滴管等 【操作步骤】 1.凝胶溶胀
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理 一、凝胶过滤层析的概念和原理 凝胶过滤层析是一种常用的生物化学分离技术，主要用于蛋白质的精 细纯化和分离。其原理是利用凝胶颗粒的孔隙结构，根据蛋白质的大 小和形状差异，使不同分子量和形状的蛋白质在凝胶颗粒的孔隙中发 生不同程度的阻滞和流动，从而实现蛋白质的分离和纯化。 二、凝胶过滤层析的操作步骤 1. 样品加载：将待纯化的蛋白样品均匀地加载到预先平衡的凝胶柱或 凝胶板上。 2. 洗脱：用缓冲液通过凝胶柱，洗去未结合的蛋白和其他杂质。 3. 洗脱物收集：收集洗脱液中的目标蛋白。 4. 分析和检测：对收集的蛋白样品进行分析和检测。 三、凝胶过滤层析的优点和适用范围 1. 分辨率高：凝胶过滤层析能够分离不同分子量的蛋白，分辨率较高。 2. 操作简单：操作过程不需要高昂的设备和特殊技能，相对容易进行。 3. 适用范围广：适用于各种不同分子量和性质的蛋白质的纯化和分离。
四、对凝胶过滤层析的个人理解和观点 凝胶过滤层析作为一种生物化学分离技术，在蛋白质纯化领域有着广 泛的应用。它的原理简单易懂，操作相对容易，且适用范围广，因此 备受科研人员的青睐。在生物制药和基因工程等领域，凝胶过滤层析 也发挥着重要的作用，为蛋白质的纯化和分离提供了有效的技术手段。 总结：凝胶过滤层析作为一种重要的蛋白质纯化技术，具有分辨率高、操作简单、适用范围广等优点。通过对凝胶过滤层析的深入理解和掌握，能够为生物化学研究和生物制药领域的发展提供有力支持。 通过本文的深度探讨，相信您对凝胶过滤层析进行蛋白纯化的原理有 了更深入的了解。希望本文能够帮助您更全面、深刻和灵活地理解这 一主题。凝胶过滤层析属于分子量分馏技术，是一种物理性质分离方法。它基于蛋白质在凝胶柱内孔隙中的迁移速度的差异，可以将混合 物中的不同分子量的蛋白质分离开来。对于高分子量的蛋白质来说， 凝胶柱内的孔隙会成为一个障碍，从而使它们在柱内停留的时间更长，而低分子量的蛋白质会更容易通过孔隙，因此在经过相同时间的洗脱后，不同分子量的蛋白质就可以被有效地分离开来。 在进行凝胶过滤层析时，首先需要准备好凝胶柱或凝胶板。常见的凝 胶材料有琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。选择合适的凝胶材料可以使得 孔隙大小合适，从而适应不同分子量范围的蛋白质分离。接下来，需
竭诚为您提供优质文档/双击可除凝胶层析分离混合蛋白实验报告 篇一：凝胶过滤法分离蛋白质实验报告 凝胶过滤法分离蛋白质 一、实验目的 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 二、实验原理 凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及 固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按
大到小的顺序流出实现分离的目的。 三、试剂与仪器 0.1mol/L磷酸缓冲液（ph7.0），0.4%K3Fe(cn)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血 1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒 四、实验步骤 1.凝胶溶胀 2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。 3.样品处理 4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm 处沿管内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。 5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色 篇二：生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法