蛋白质的分离过程
蛋白质是生物体内一类重要的有机化合物，其在细胞内发挥着多种重要的生物学功能。为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们经过多年的努力，发展出了一系列的蛋白质分离技术。本文将从蛋白质的提取、分离和纯化三个方面介绍蛋白质的分离过程。
一、蛋白质的提取
蛋白质的提取是蛋白质分离的第一步，其目的是将含有蛋白质的样品从细胞或组织中提取出来。常用的提取方法有机械破碎法、溶液浸提法和超声波法等。其中，机械破碎法是将样品经过机械力的作用破碎，释放出蛋白质；溶液浸提法是将样品放入适当的溶液中，使蛋白质溶解出来；超声波法则是利用超声波的作用力将蛋白质从细胞或组织中释放出来。通过这些方法，可以获得含有蛋白质的提取液。
二、蛋白质的分离
蛋白质的分离是将提取液中的蛋白质按照某种特定的性质进行分离的过程。根据蛋白质的不同特性，可以采用不同的分离方法。常用的分离方法有电泳法、层析法和离心法等。
1. 电泳法
电泳法是利用蛋白质在电场中的运动性质进行分离的方法。根据蛋白质的电荷、分子量或等电点的不同，可采用凝胶电泳、等电聚焦
电泳等不同的电泳方法。其中，凝胶电泳是将蛋白质样品通过凝胶的孔隙进行分离，常用的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。等电聚焦电泳则是根据蛋白质在等电点附近具有零电荷的特性进行分离。通过电泳法，可以将蛋白质按照其电荷或分子量的大小进行分离。
2. 层析法
层析法是根据蛋白质在某种固定相和流动相的作用下，通过不同的亲和性进行分离的方法。根据固定相的不同，层析法可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等多种类型。其中，凝胶过滤层析是根据蛋白质的分子大小进行分离，较大分子的蛋白质会被阻滞在凝胶中，而较小分子的蛋白质则能通过凝胶。离子交换层析则是根据蛋白质的电荷进行分离，蛋白质与固定相上的离子进行电荷交换，从而实现分离。亲和层析是利用蛋白质与固定相上的配体之间的特异性亲和作用进行分离，通过调节流动相的条件，实现蛋白质的分离。
3. 离心法
离心法是利用离心机的离心力将样品中的蛋白质按照其密度进行分离的方法。根据蛋白质的密度不同，可采用不同的离心力和离心时间进行分离。离心法可用于分离含有不同密度蛋白质的混合物，通常将样品离心后，将上清液中的蛋白质收集下来，即可得到纯化的蛋白质。
三、蛋白质的纯化
蛋白质的纯化是将分离得到的蛋白质进一步提纯的过程。纯化的目的是去除杂质，使蛋白质的含量更高，纯度更高。常用的纯化方法有沉淀法、渗透层析法和亲和纯化法等。
1. 沉淀法
沉淀法是将蛋白质通过加入适当的沉淀剂使其沉淀出来的方法。常用的沉淀剂有醇类、盐类和有机溶剂等。通过调节沉淀剂的种类和浓度，可以将蛋白质与杂质分离，从而实现蛋白质的纯化。
2. 渗透层析法
渗透层析法是利用溶剂的渗透压差异，通过渗透层析柱将蛋白质与杂质分离的方法。渗透层析柱中填充有具有不同分子量的透析膜，蛋白质与杂质在渗透膜上的渗透速率不同，从而实现分离纯化。
3. 亲和纯化法
亲和纯化法是利用蛋白质与特定配体之间的亲和作用进行纯化的方法。通过将配体固定在固定相上，将蛋白质溶液通过亲和柱，蛋白质与配体之间发生特异性结合，其他杂质则被洗脱，从而实现蛋白质的纯化。
蛋白质的分离过程包括蛋白质的提取、分离和纯化三个步骤。通过合理选择提取方法、分离方法和纯化方法，可以得到高纯度的蛋白
质样品，为蛋白质的进一步研究和应用奠定基础。在今后的研究中，科学家们还将继续改进和发展蛋白质分离技术，以满足对蛋白质的更深入研究的需求。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质的提取和分离一般分为四步样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的去除 ②方法离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效 果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入 再加入用的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间） ⑥重复4、5步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化， 不可洗涤次数过少。 (2)血红蛋白的释放 加到体积，再加40％体积的溶解细胞膜），置于上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3) 分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层 第1层（最上层）甲苯层 第2层（中上层）的沉淀层，色薄层固体 第3层（中下层）的水溶液层，的液体 第4层（最下层）其它杂质的沉淀层 (4)透析 2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔； b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在0.5ml的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔 内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。 c.剪尼龙网小圆片覆盖在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。 d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一 端放入收集的收集器内 ③顶塞的制作插入安装了玻璃管的橡皮塞 ④组装将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择。
蛋白质分离纯化步骤
一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度
蛋白质的分离过程 蛋白质是生物体内一类重要的有机化合物，其在细胞内发挥着多种重要的生物学功能。为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们经过多年的努力，发展出了一系列的蛋白质分离技术。本文将从蛋白质的提取、分离和纯化三个方面介绍蛋白质的分离过程。 一、蛋白质的提取 蛋白质的提取是蛋白质分离的第一步，其目的是将含有蛋白质的样品从细胞或组织中提取出来。常用的提取方法有机械破碎法、溶液浸提法和超声波法等。其中，机械破碎法是将样品经过机械力的作用破碎，释放出蛋白质；溶液浸提法是将样品放入适当的溶液中，使蛋白质溶解出来；超声波法则是利用超声波的作用力将蛋白质从细胞或组织中释放出来。通过这些方法，可以获得含有蛋白质的提取液。 二、蛋白质的分离 蛋白质的分离是将提取液中的蛋白质按照某种特定的性质进行分离的过程。根据蛋白质的不同特性，可以采用不同的分离方法。常用的分离方法有电泳法、层析法和离心法等。 1. 电泳法 电泳法是利用蛋白质在电场中的运动性质进行分离的方法。根据蛋白质的电荷、分子量或等电点的不同，可采用凝胶电泳、等电聚焦
电泳等不同的电泳方法。其中，凝胶电泳是将蛋白质样品通过凝胶的孔隙进行分离，常用的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。等电聚焦电泳则是根据蛋白质在等电点附近具有零电荷的特性进行分离。通过电泳法，可以将蛋白质按照其电荷或分子量的大小进行分离。 2. 层析法 层析法是根据蛋白质在某种固定相和流动相的作用下，通过不同的亲和性进行分离的方法。根据固定相的不同，层析法可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等多种类型。其中，凝胶过滤层析是根据蛋白质的分子大小进行分离，较大分子的蛋白质会被阻滞在凝胶中，而较小分子的蛋白质则能通过凝胶。离子交换层析则是根据蛋白质的电荷进行分离，蛋白质与固定相上的离子进行电荷交换，从而实现分离。亲和层析是利用蛋白质与固定相上的配体之间的特异性亲和作用进行分离，通过调节流动相的条件，实现蛋白质的分离。 3. 离心法 离心法是利用离心机的离心力将样品中的蛋白质按照其密度进行分离的方法。根据蛋白质的密度不同，可采用不同的离心力和离心时间进行分离。离心法可用于分离含有不同密度蛋白质的混合物，通常将样品离心后，将上清液中的蛋白质收集下来，即可得到纯化的蛋白质。
一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。 二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提
蛋白质的分离与纯化 蛋白质分离纯化的基本流程 选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离蛋白质的抽提蛋白质的纯化浓缩、干燥和保存 一、材料的选择和预处理 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目 的来确定。 从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。 对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和 脂肪组织。 对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应 选用新鲜材料制备。 二、细胞的破碎 （一）机械方法：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。 高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），适用于动物内脏组织的破碎。 玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料；也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度比高速捣碎机高，机械 切力对分子破坏较小。 小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。（二）物理方法：主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎。 反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 超声波法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料；只要有设备，该法方便且效果也好，但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质酶时宜慎重。 （三）化学及生物化学法 有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏；细菌细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果更好。此外一些细胞膜较脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。 细胞器的分离 制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子，防止其他细胞组分的干扰，细胞破碎后常将细胞内各组分先行分离，以便于获得更好的分离效果。 细胞器的分离一般采用差速离心法 细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。 细胞器的分离制备，介质的选择现一般用蔗糖、Ficoll或葡萄糖-聚乙二醇等溶液。 三、蛋白质的提取 提取是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一定条件下的溶剂中，让被提取的蛋白质以溶解状态充分地释放出来，并尽可能保持原来的天然状态，不丢失生物活性的过程。 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。 抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程 蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 实验步骤 一：材料准备 1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠 2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒 二：实验操作 1.试剂准备： 2. 2. 获得目的基因 ①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。 ②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。 3. 构建重组表达载体 ①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。 ②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。 4. 获得含重组表达质粒的表达菌种 ①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 ②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 ③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。 5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 ①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。 ②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。 ③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG 至终浓度0.5 mmol/l，37 ℃继续培养1～3 h。 ④12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20 ℃或-70 ℃冰箱中。
蛋白质分离纯化步骤 一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。 二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法
简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂
提取蛋白质步骤 蛋白质是生物体内最重要的官能分子之一，是组成生物体的重要基础。在生物学领域，蛋白质的提取方法是非常重要的。下面，我们将介绍蛋白质的提取步骤。 1. 细胞破碎 蛋白质存在于细胞内，因此需要将细胞破碎，以释放蛋白质。破碎细胞的方法有多种，如超声波破碎、高压破碎、玻璃珠破碎等。 2. 去除杂质 细胞破碎后，需要去除杂质。可以采用离心的方法，将混合液放入离心管中，通过高速离心，使得蛋白质与其他杂质分离出来。此外，还可以使用滤纸、膜过滤等方法去除杂质。 3. 溶解 蛋白质在溶液中存在，因此需要将其溶解。常用的溶解液有生理盐水、PBS缓冲液等。在溶解时，需要控制溶液的pH值和温度，以避免对蛋白质的影响。 4. 蛋白质分离 蛋白质的分离方法有多种，如电泳、层析、免疫亲和等。其中，电
泳是常用的方法之一，可以根据蛋白质的大小、电荷等性质进行分离。层析法根据分子量、亲和性等原理进行分离。免疫亲和法则是针对特定蛋白质，利用抗体对其进行识别和分离。 5. 蛋白质纯化 蛋白质分离后，还需要进行纯化，以去除杂质。纯化方法有多种，如柱层析、凝胶过滤、亲和层析等。不同的纯化方法适用于不同类型的蛋白质。 6. 蛋白质定量 蛋白质定量是一个重要的步骤，可以确定提取的蛋白质含量。常用的定量方法有比色法、Bradford法、BCA法等。这些方法都可以通过对特定试剂与蛋白质反应，从而测定蛋白质的含量。 7. 蛋白质保存 提取的蛋白质需要保存，以便后续实验使用。常用的保存方法有冰冻保存、干燥保存等。在保存时，需要注意蛋白质的稳定性，选择合适的保存条件。 总结 以上是蛋白质提取的基本步骤，每个步骤都需要仔细操作，以确保提取出的蛋白质纯度和含量的准确性。在实验过程中，需要根据具
蛋白的分离名词解释 蛋白质是构成生物体基本组成部分的有机大分子，由一系列α-氨基酸残基经肽键连接而成。它是生物体内所有细胞器官、组织和体液中的重要成分，参与生物体的各种生理活动，如结构、运输、代谢、免疫等。蛋白的分离是指将混合物中的蛋白质分离出来，以便进一步研究其特性和功能。 蛋白质的分离过程通常包括以下几个步骤：样品制备、分离和纯化。 首先，样品制备的目的是将待分离的蛋白质从生物样品中提取出来。样品可以是血清、细胞组织或其他生物样本，其中含有丰富的蛋白质。样品制备的方法可以根据不同种类的样品进行调整，常见的方法包括细胞溶解、组织切割和提取等。 在分离蛋白质的过程中，常用的方法包括电泳、层析和离心等。其中，电泳是最常见的方法之一。它是利用电场的作用使蛋白质在凝胶中分离的一种方法。电泳又可以分为凝胶电泳和毛细管电泳两种。凝胶电泳适用于分离相对较大分子量的蛋白质，而毛细管电泳适用于分离较小分子量的蛋白质。层析是另一种常用的分离方法，它是利用不同介质对蛋白质的亲和性差异进行分离。离心则是利用离心力将不同密度的蛋白质分离开来。 在蛋白质的纯化过程中，常用的方法有高性能液相色谱法（HPLC）、亲和层析和透析等。其中，HPLC是一种高效的纯化方法，它基于溶液在色谱柱中的分配系数来实现蛋白质的分离。亲和层析法是一种结合蛋白质与固定相之间的特异相互作用进行分离的方法，常见的亲和层析柱有亲合剂和亲和剂。透析则是利用半透膜将溶液中的小分子离子、蛋白质和其他溶质分离开来，从而实现蛋白质的纯化。 蛋白质分离的目的是得到纯度较高的蛋白质，以便进行后续的功能研究和结构解析。在分离过程中，需要控制各种因素，如温度、pH值、离子浓度等，以确保蛋白质的稳定性和活性。此外，还需要使用适当的检测方法来确定蛋白质的分离程度和纯度。
文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持. 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。 1
分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白
质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析 （三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用 氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法
蛋白质分离纯化步骤一、蛋白质分 离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯 化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋
白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0〜4C 的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要釆用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张