蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：
（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：
1.机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法
生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
（―）蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：
1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使
用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分
离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
卵清蛋白分离提取及纯化的具体试验步骤
一、实验目的与原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为l：lo鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的腺都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。
二、材料与试剂：1.材料：新鲜鸡蛋2只
2:仪器：抽滤瓶500- lOOOmK烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器
3：试剂:
10%TCA,用固体NaOH 调调PH 至1.05— 1. 10,需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-O. 05M , PH8. OTris-HCL 缓冲液（每ml 含0. 34BAEE 和
2.22mgCaCL2） , 50ml pH8. 0, 0. IM Tris-HCL 缓冲液
三、操作步骤
1,取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml,置于烧杯中，外用温水浴25C — 30C,在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸一丙酮（1：2V/V）,立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3. 5,再继续搅拌30min,然后在4C冰箱中放置过夜。
2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。
3,边搅拌边加入4C预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4C放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min,收集沉淀。
4,将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h,换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。
抗菌蛋白分纯的步骤
准备试剂：异丙醇含0. 3M盐酸弧的95汇醇无水乙醇1%SDS
操作步骤：
1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用lml TRIzol加1. 5ml异丙
醇，室温放置10分钟，2〜8C 12000Xg离心10分钟弃上清。
2.用含0. 3M盐酸弧的95%L醇洗涤蛋白质沉淀。每使用lmlTRIzol加2ml洗涤液，室温
放置20分钟，2〜8C 7500Xg离心5分钟，弃上清，重复两次。用2nd无水乙醇同样方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白质沉淀5-10分钟，用1%SD溶解蛋白质，反复吸打，50C温浴使其完全溶解，不溶物2〜8C lOOOOXg离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot 或-5至-20 C保存备用。
注意事项：
1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸弧的95聽醇或无水乙醇中2-8° C—个月以上或- 5至-20 C—年以上。
2.用0.1% SDS在2-8C透析三次，lOOOOXg离心10分钟取上清即可用于Western
Blot o
常见问题分析：
得率低：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底。
B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。
丫球蛋白分离，纯化，鉴定的方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项）
［原理］
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、a, 1-球蛋白、a 2-球蛋白、B - 球蛋白和丫 -球蛋白，其中丫 -球蛋白含量约占16%, 100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸钱）溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸钱溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有丫-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验釆用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG—25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孑L,而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分
离。a—球蛋白、B -球蛋白的PK6.0 ；丫一球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6. 3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的a —球蛋白和B -球蛋白能与DEAE
纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的丫一球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有丫-球蛋白，从而使丫 -球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：
用上述方法分离得到丫 -球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的丫 -球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
［操作］
⑴盐析一一中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9 %氯化钠溶液2. 0ml, 边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸钱溶液乙 4. 0ml,混匀后于室温中放
置lOmin, 3000r/min离心10min o小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0. 0175mol/L磷酸盐缓冲液（pH6. 3）0. 5-1. 0ml使之溶解。此液即为粗提的丫一
球蛋白溶液。
（2）脱盐一一凝胶柱层析
①装柱
洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3nil/niin。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。
②上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在
0. 25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0. 0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6. 3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。
加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0・5nil/niin,用部分收集器收集,每管lml o
③洗脱液中NH4与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，
按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20%磺基水杨酸溶液2滴，出现白
色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液1滴，以观察NH4出现的
情况。
合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余川DEAE千
维素阴离子交换柱进一步纯化。
(3)纯化一一DEAE千维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，
并用0. 0175mol /L磷酸盐缓冲液(pH6. 3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20%磺基
水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。
(4)浓缩一一经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的丫一球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴
定，常需浓缩。收集较浓的纯化的丫一球蛋白溶液2nd,按每ml加0. 2〜0. 25gSephadex G - 25干胶，摇动2-3min, 3000r /min离心5min o上清液即为浓缩的丫 -球蛋白溶液。
(5)鉴定一一乙酸纤维素薄膜电泳取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋
白、DEAE千维素阴离子交换柱纯化的丫 -球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十四：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。
［注意事项］
(1)凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及千维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。
(2)装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE 千维素混悬液不稀不厚，一般浓度为I : 1,进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。
(3)本法是利用丫 -球蛋白的等电点与a -、B -球蛋白不同，用离子交换层析
法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。
(4)电泳注意事项见实验二十四。
(5)凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如
0. 02 %叠氮钠。保存于4C冰箱内。若长期不用，应脫水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95%乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60〜
80 C烘干贮存。
(6)离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以C1型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般千维素浸泡时间为3-4h o
离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0. 02%叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。
除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析岀后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馆水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高浓缩丫 -球蛋白粗提液除上述方法外还可川透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000),或聚乙烯毗咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都
可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10 C以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如SephadexG — 25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。
［试剂］
(1)饱和硫酸钱溶液：称固体硫酸钱(分析纯)850g,置于1000ml蒸馅水中，在70 — 80C 水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2,室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸钱溶液。
(2)葡聚糖凝胶G- 25的处理：按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G
一25干胶25g o称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸懈水约30ml,用玻
璃棒轻轻混匀，置于90-100C水温中时时搅动，使气泡逸出。lh后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h,搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸憾水洗涤2 〜3
次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6. 3)平衡，备用。
(3)DEAE 一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理：按100ml柱床体积需DEAE千维素14g称取，每克加0. 5mol /L盐酸溶液15ml,搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约10倍量的蒸馆水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min,虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为
0. 5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min,以虹吸除去上层液体。同上用蒸懈水反复洗至pH 〈7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0. 0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6・3)平衡，备用。
(4)0. 0175mol /L 磷酸盐缓冲液(pH6. 3)
A液：称取磷酸二氢钠(NaH2P04. 2H20)2. 730g溶于蒸馅水中，加蒸馆水稀释至lOOOmlo B液：称取磷酸氢二钠(Na2HP04. 12H20)6. 269g,溶于蒸馆水中，加蒸憾水稀释至lOOOmLo
取A液77. 5ml,加于B液22. 5ml,混匀后即成。
(5)20%磺基水杨酸溶液
(6)奈氏(Nessler)试剂应用液
①贮存液；称取碘化钾(Kl)7. 58于250ml三角烧瓶中，用蒸馆水5ml溶解，再加入
碘(12 ) 5. 5g溶解，力口7〜7.5gHg用力振摇10min(此时产生高热，须冷
却)，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml
容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馆水稀释至100mlo
②应用液：取贮存液75ml加10% NaOH 3引加加水至500mL
(7)0.9 %氯化钠溶液
(8)乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂(见实验二十四)
(四)亲和层析
生物体中许多高分子化合物之间具有专一性可逆结合的特征，例如：酶蛋白和辅酶，抗原和抗体，激素与受体，核糖核酸与互补的脱氧核糖核酸等。生物分子间的这种专一性结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和力大小产生吸附和解吸作用而建立的层析方法称为亲和层析。
亲和层析的基本过程如下：具有亲和力的一对分子，其中一种分子作为配基，固定化结合在不溶性载体上装入层析柱成亲和柱，当含有另一种分子的混合液作为流动相流入亲和柱时，能与配基亲和结合的分子被吸附，其它杂质直接流出，再改变流动相的溶液，使配基与其亲和物解离从而解吸出待分离的分子来。
亲和层析中最常用的具有亲和力的生物体系有：
酶：底物、抑制剂、辅酶抗体：抗原、病毒、细胞外源凝集素：受体、载体蛋白细胞：细胞表面特异蛋白，外源性凝集素
蛋白质纯化方案 随着生物技术的发展和应用的广泛性，蛋白质的纯化变得越来越重要。蛋白质纯化是一种从生物来源中分离出纯净蛋白质的过程，通常需要一系列的步骤和方法来达到高纯度的目标。本文将介绍两种常用的蛋白质纯化方案：离子交换和亲和层析。 一、离子交换 离子交换是一种常用的蛋白质纯化技术，它基于蛋白质中的电荷性质来进行分离。该方法的原理是利用固定在离子交换介质上的带电基团与蛋白质中的离子交换，从而实现蛋白质的分离纯化。离子交换可以分为阳离子交换和阴离子交换两种类型。 离子交换的步骤如下： 1. 样品制备：将待纯化的蛋白质从样品中提取出来，并通过预处理步骤将其净化。 2. 样品加载：将净化后的样品加载到装有离子交换介质的柱子中。 3. 洗脱：通过改变溶剂的离子浓度、pH或离子强度，控制蛋白质与固定在介质上的带电基团的相互作用，从而实现蛋白质的洗脱。 离子交换的优点是操作相对简单，可以在常规实验室条件下进行。但是，该方法仅能实现对带电蛋白质的分离纯化，对于非带电蛋白质效果较差。 二、亲和层析
亲和层析是一种根据蛋白质与配体间的特异性相互作用来进行纯化 的方法。该方法的原理是通过利用待纯化蛋白质与某种特定配体之间 的结合，将蛋白质与杂质分离。 亲和层析的步骤如下： 1. 配体固定：将配体分子共价或非共价地固定在柱子上。 2. 样品加载：将待纯化的蛋白质样品加载到具有固定配体的柱子中。 3. 洗脱：通过改变溶剂条件或添加竞争性配体来使蛋白质洗脱。 亲和层析的优点是选择性强，可以根据需要设计特定的配体与蛋白 质相互作用，从而实现高纯度的分离。然而，亲和层析的缺点是配体 的可用性和特异性可能限制了其应用范围。 总结： 蛋白质纯化是生物技术中至关重要的一环。离子交换和亲和层析是 常用的蛋白质纯化方案。离子交换基于蛋白质中的电荷性质进行纯化，适用于带电蛋白质的分离；亲和层析则基于特定配体与蛋白质的相互 作用实现纯化，适用于选择性分离。根据待纯化蛋白质的性质和需求 可以选择合适的纯化方案，为后续的研究和应用提供高纯度的蛋白质 样品。
蛋白纯化步骤 引言： 蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。 一、细胞裂解和收集 蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。 二、沉淀和上清液分离 细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。 三、蛋白质分子量筛选 蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。
四、亲和纯化 亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。 五、离子交换层析 离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。 六、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。 七、逆流层析 逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。
生物大分子蛋白质分离纯化的方法 一、蛋白质分离纯化的基本原理 蛋白质分离纯化的目的是将混合的蛋白质样品中的目标蛋白质分离出来，并获得高纯度的目标蛋白质。通常分离纯化的基本原理是利用蛋白质在特定条件下的物理、化学或生物学性质差异，通过不同的分离纯化方法将目标蛋白质从其他蛋白质或杂质中分离出来。 二、常用的蛋白质分离纯化方法 1. 直接提取法 直接提取法是将细胞或组织破碎后，利用溶液提取目标蛋白质。通常使用的提取溶液包括生理盐水、缓冲液和提取剂等。该方法适用于蛋白质溶解度高、目标蛋白质稳定性好的情况。 2. 超速离心法 超速离心法是通过不同蛋白质在离心力作用下的沉降系数差异来分离蛋白质。可以根据蛋白质的分子量、形状和密度等特性，选择合适的离心速度和时间进行分离。常用的超速离心设备有超速离心机和超速离心管等。 3. 过滤法 过滤法利用蛋白质的分子大小差异，通过过滤膜将目标蛋白质分离出来。常用的过滤膜有纤维膜、微孔膜和凝胶膜等。根据目标蛋白质的分子大小选择合适的过滤膜孔径进行分离。
4. 离子交换层析法 离子交换层析法是利用蛋白质与离子交换树脂之间的相互作用来分离蛋白质。树脂中固定的离子可以与目标蛋白质的带电部分发生静电相互作用，从而实现分离纯化。常用的离子交换树脂有正离子交换树脂和负离子交换树脂等。 5. 亲和层析法 亲和层析法是利用目标蛋白质与亲和基质之间的特异性结合来分离蛋白质。亲和基质可以是与目标蛋白质特异结合的抗体、亲和标记的配体或金属离子等。通过与亲和基质的特异结合，目标蛋白质可以在层析过程中被选择性地捕获和纯化。 三、蛋白质分离纯化的步骤 1. 样品制备 将细胞或组织破碎，并加入适量的缓冲液进行均质处理，使蛋白质溶解。 2. 分离提取 根据目标蛋白质的特性选择合适的分离方法，如过滤法、离子交换层析法或亲和层析法等，将目标蛋白质从混合物中分离出来。 3. 纯化加工 通过一系列的纯化加工步骤，如洗脱、浓缩、去除杂质等，进一步提高目标蛋白质的纯度。
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
分离提纯蛋白质的方法 分离和提纯蛋白质是生物化学和生物技术领域中的重要研究内容之一、蛋白质的分离和提纯过程通常包括以下几个步骤：细胞破碎、表达和纯化 蛋白质。 第一步：细胞破碎 为了获得足够的蛋白质用于分离和提纯，需要首先破碎细胞以释放细 胞内的蛋白质。有多种方法可以破碎细胞，常见的包括机械破碎、超声波 破碎、高渗溶液处理和酶解等。 机械破碎是最常用的方法之一，可以通过物理力量来破碎细胞壁。常 见的机械破碎方法包括搅拌、震荡、球磨研磨和高压破碎等。 超声波破碎则是利用超声波的高能量作用于细胞，使细胞破裂。超声 波能够产生涡流和剪切力，从而破坏细胞结构。 高渗溶液处理是利用高渗溶液渗透细胞并破坏细胞膜的完整性。常见 的高渗溶液包括高盐溶液、高浓度蔗糖溶液和高浓度尿素溶液等。 酶解是利用特定的酶来分解细胞壁和膜的方法。常见的酶解剂包括胰 蛋白酶、凝集酶、丝氨酸蛋白酶等。 第二步：表达和纯化蛋白质 在蛋白质表达和纯化的过程中，有多种技术可以用于分离和提纯蛋白质。常见的方法包括柱层析、电泳和过滤等。 柱层析是一种基于物质的分离原理的技术，将混合物通过填充在柱中 的固定相进行分离。常见的柱层析技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、
亲和层析和逆相层析等。这些柱层析方法根据蛋白质的特性选择适当的柱填料和缓冲液来实现分离和提纯。 电泳是利用蛋白质的电荷和大小差异来分离的方法。著名的电泳技术包括凝胶电泳和等电聚焦。凝胶电泳可以将蛋白质按照其分子量的大小进行分离，常见的凝胶电泳方法有SDS-和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。等电聚焦则是根据蛋白质的等电点来进行分离，通过设置不同的等电聚焦梯度使蛋白质在凝胶上定位。 过滤是一种基于蛋白质分子大小的分离方法。常用的过滤技术包括固体相过滤、凝胶过滤和超滤等。这些方法通过调整过滤膜的孔径或分子量截留限制，将蛋白质分离和提纯。 此外，还可以结合其他方法如亲和纯化、胶束凝聚、洗钙凝聚、冷酮酸不溶性结晶法等进行蛋白质的分离和提纯。 总之，蛋白质的分离和提纯是复杂而多步骤的过程，需要综合应用不同的技术和方法。不同的蛋白质特性和实验目的会决定选择适当的技术和方法。
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤 凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化技术，可用于分离和富集目标蛋白。其原理是利用凝胶材料的孔隙大小和蛋白分子的大小差异，通过层析柱中的凝胶层对混合蛋白进行分离。这种方法操作简单，效果稳定，是许多实验室常用的蛋白纯化方法之一。 下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤： 1. 准备工作 在开始实验之前，首先需要准备层析柱和凝胶。层析柱可以使用预填充的封闭柱，也可以自己制备。常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶（PAA）和琼脂糖凝胶。根据实验需求和目标蛋白的分子量，选择合适的凝胶孔隙大小。 2. 样品的制备 将待纯化的蛋白样品制备好。通常需要将样品溶解于缓冲液中，并添加一定的抑制剂，以防止蛋白的降解和活性丢失。在制备样品时，可以根据需要对蛋白进行特定的标记或修饰。 3. 样品的加载 将制备好的蛋白样品加载到层析柱上。可以使用注射器或微量移液器将样品缓慢地滴加到层析柱顶部。为了保证样品的均匀加载，可以在样品前后添加一定量的缓冲液。
4. 蛋白的分离 一旦样品加载完毕，蛋白分子将开始在凝胶层中进行分离。较小的蛋白分子能够进入凝胶孔隙，而较大的蛋白分子则无法进入，从而实现了蛋白的分离。分离过程中，可以通过重力流动或离心力来推动样品通过层析柱。 5. 洗脱纯化蛋白 待纯化的蛋白通常会与凝胶层中的其他成分发生相互作用，如亲和作用或静电作用。为了洗脱纯化的蛋白，可以使用适当的洗脱缓冲液。洗脱缓冲液中的成分可以改变蛋白与凝胶层之间的相互作用，使蛋白从凝胶中解离出来。 6. 收集纯化蛋白 洗脱后的蛋白溶液即为纯化蛋白，可以通过收集溶液进行后续的实验或分析。为了保证蛋白的完整性和活性，收集的溶液应该尽快进行保存或下一步实验。 总结： 凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过凝胶层的孔隙大小与蛋白分子的大小来实现蛋白的分离。其步骤包括准备工作、样品制备、样品加载、蛋白分离、洗脱纯化蛋白和收集纯化蛋白。这种方法操作简单，适用于不同分子量的蛋白纯化，是许多实验室常用的技术之一。在实验过程中，需要注意样品的制备和加载，以及选择合适的凝胶材料和洗脱缓冲液。通过凝胶过滤层析，可以得到高
蛋白质纯化常用方法 蛋白质纯化是一种分离高纯度蛋白质的过程，可用于研究物种的功能和结构。蛋白质纯化可以是一个繁琐的过程，通常需要多步骤的分离和纯化。以下是一些常见的蛋白质纯化方法。 一、离心分离 离心分离是根据蛋白质的分子量和密度差异来分离不同的成分。高速离心法可分离细胞质组分、胞器、膜蛋白和核酸等。低速离心法可从混合物中净化纤维蛋白、酶、酰化酶等。 二、盐析 盐析是将溶液中的蛋白质与一定饱和度的盐混合后，通过离子间作用而使蛋白质发生沉淀的过程。盐的浓度、pH值、离子类型和温度等因素会影响到沉淀的生成和纯度。盐析也可以通过凝胶过滤或离子交换等方法来提高效果和纯度。 三、凝胶柱层析 凝胶柱层析是一种将混合物缓慢地通过一个由多种凝胶材料组成的列的过程。该列可根据蛋白质大小、电荷、亲疏水性等特性进行选择。通过这种方法，可以净化蛋白质并快速消除杂质、缓解蛋白结构等。 四、亲和层析 亲和层析是一种利用配体与蛋白质间的特定的结合进行选择性分离的技术。配体通常被共价结合在凝胶上, 一些常见的配体包括金属离子、抗体和亲和素等。通过这种方法，可以高效且选择性地纯化蛋白质，并减少染料、盐和杂质的存在。 五、电泳 电泳是根据蛋白质的电荷大小将充电的蛋白质分离开的过程。根据电泳类型不同，可以区分不同细胞蛋白、酶、抗体等。蛋白质电泳在生物化学实验室中广泛应用，是一种可视化分离的传统方法。 六、共沉淀 共沉淀是基于化合物的亲和性，在溶液中同时存在的两种蛋白质之间发生非共价结合的过程。通过共沉淀获得的纯化蛋白质收率较高但一般会伴随着蛋白质活性的损失。 总之，纯化蛋白质的过程需要结合样品的特性和分离纯化方式的优点和局限性，选择合适的技术来获得高纯度和活性的蛋白质。
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程 引言： 蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。 一、凝胶过滤层析的原理 凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。该方法利用特定的凝胶材料，通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中，较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部，而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。通过这种方式，可以实现对蛋白的分离和纯化。 二、凝胶过滤层析的步骤 1. 准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。 2. 杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。 3. 样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。 4. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。 5. 收集纯化蛋白：将目标蛋白收集，可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。
三、凝胶过滤层析的优势和应用 凝胶过滤层析具有以下优势： 1. 无需特殊设备：相较于其他蛋白纯化方法，凝胶过滤层析不需要昂贵的设备，操作简单方便。 2. 高分辨率：凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离，得到高纯度的目标蛋白。 3. 适用范围广：凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白，包括酶、抗体、细胞因子等。 凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下方面：1. 蛋白纯化：凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一，可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。 2. 质量控制：凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度，对蛋白质的质量进行评估。 3. 蛋白互作研究：凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子（如核酸或小分子化合物）的相互作用。 4. 蛋白结构分析：凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。 结论： 凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。该方法在生物学研究中有广泛的应用，可以用于蛋白纯化、质量控制、蛋白互作研究和蛋
蛋白质纯化实验步骤 引言: 蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。 一、样品制备 在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。 二、离心 将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。 三、初步分离 将离心后的上清液取出，进行初步分离。可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。 四、亲和层析
亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。 五、凝胶电泳 凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。 六、柱层析 柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。 七、透析 透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。 八、浓缩 浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据
蛋白质分离纯化步骤
一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。
力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度
蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。 蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法： 一、根据分子大小不同分离纯化： 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。 1、透析和渗滤： 主要利用半透膜 透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。 这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。 2、离心 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。 3、凝胶过滤
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。 凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。 二、根据溶解度不同分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多，比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。 但在同一条件下，不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。 常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 1、等电点沉淀和pH值调节 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低；相反，有些蛋白质在一定pH 值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。 2、蛋白质的盐溶和盐析 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。 盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后，通常要使用透析或者
蛋白质的分离过程 蛋白质是生物体内一类重要的有机化合物，其在细胞内发挥着多种重要的生物学功能。为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们经过多年的努力，发展出了一系列的蛋白质分离技术。本文将从蛋白质的提取、分离和纯化三个方面介绍蛋白质的分离过程。 一、蛋白质的提取 蛋白质的提取是蛋白质分离的第一步，其目的是将含有蛋白质的样品从细胞或组织中提取出来。常用的提取方法有机械破碎法、溶液浸提法和超声波法等。其中，机械破碎法是将样品经过机械力的作用破碎，释放出蛋白质；溶液浸提法是将样品放入适当的溶液中，使蛋白质溶解出来；超声波法则是利用超声波的作用力将蛋白质从细胞或组织中释放出来。通过这些方法，可以获得含有蛋白质的提取液。 二、蛋白质的分离 蛋白质的分离是将提取液中的蛋白质按照某种特定的性质进行分离的过程。根据蛋白质的不同特性，可以采用不同的分离方法。常用的分离方法有电泳法、层析法和离心法等。 1. 电泳法 电泳法是利用蛋白质在电场中的运动性质进行分离的方法。根据蛋白质的电荷、分子量或等电点的不同，可采用凝胶电泳、等电聚焦
电泳等不同的电泳方法。其中，凝胶电泳是将蛋白质样品通过凝胶的孔隙进行分离，常用的凝胶电泳有聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。等电聚焦电泳则是根据蛋白质在等电点附近具有零电荷的特性进行分离。通过电泳法，可以将蛋白质按照其电荷或分子量的大小进行分离。 2. 层析法 层析法是根据蛋白质在某种固定相和流动相的作用下，通过不同的亲和性进行分离的方法。根据固定相的不同，层析法可分为凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等多种类型。其中，凝胶过滤层析是根据蛋白质的分子大小进行分离，较大分子的蛋白质会被阻滞在凝胶中，而较小分子的蛋白质则能通过凝胶。离子交换层析则是根据蛋白质的电荷进行分离，蛋白质与固定相上的离子进行电荷交换，从而实现分离。亲和层析是利用蛋白质与固定相上的配体之间的特异性亲和作用进行分离，通过调节流动相的条件，实现蛋白质的分离。 3. 离心法 离心法是利用离心机的离心力将样品中的蛋白质按照其密度进行分离的方法。根据蛋白质的密度不同，可采用不同的离心力和离心时间进行分离。离心法可用于分离含有不同密度蛋白质的混合物，通常将样品离心后，将上清液中的蛋白质收集下来，即可得到纯化的蛋白质。
蛋白质的表达、分离、纯化实验流程 蛋白质表达、分离、纯化可以：（1）探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理；（2）供作结构与功能的研究；（3）作为催化剂、营养剂等。 实验步骤 一：材料准备 1. 实验材料：大肠杆菌BL21、LB 液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠 2. 实验仪器：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒 二：实验操作 1.试剂准备： 2. 2. 获得目的基因 ①PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。 ②通过RT-PCR 方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。 3. 构建重组表达载体 ①载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。 ②PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。 4. 获得含重组表达质粒的表达菌种 ①将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp 或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 ②测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 ③以此重组质粒DNA 转化表达宿主菌的感受态细胞。 5. 氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 ①接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21 菌株于 5 mL LB 液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37 ℃震荡培养过夜。 ②按1:50 或1:100 的比例稀释过夜菌，一般转接 1 mL 过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37 ℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。 ③对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG 至终浓度0.5 mmol/l，37 ℃继续培养1～3 h。 ④12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20 ℃或-70 ℃冰箱中。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1.机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5.酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （―）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使
蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释： ### **1. 样品制备：** 蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。 ### **2. 裂解（细胞破碎）：** 样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。 ### **3. 离心：** 裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。 ### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：** 层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。 ### **5. 电泳：** 电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。 ### **6. 检测和分析：** 在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。常用的方法包括蛋白质定量、Western blotting等。这些方法可以用于确定提取得到的蛋白质是否符合预期，以及蛋白质的纯度和浓度等。 ### **7. 保存和存储：** 最后一步是保存和存储提取纯化得到的蛋白质样品。蛋白质样品应该以适当的方式存储，通常是在低温下。此外，还要考虑使用适当的缓冲液来保护蛋白质免受冻融等因素的影响。 ### **总结：** 蛋白质提取纯化是蛋白质学研究中至关重要的步骤之一。通过以上基本流程，科学家们可以从复杂的生物样品中高效、精确地提取和纯化目标蛋白质，为蛋白质研究提供了坚实的基础。在实际操作中，可以根据样品的来源、所需蛋白质的性质以及实验目的的不同，选择合适的方法和技术进行蛋白质提取纯化。