伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析 黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13 (11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095; 21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005) 摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491 bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。gG 具有膜蛋白的结构特点。 关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列 中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704 Cloning ,sequence analysis of the gG gene of Pseudorabies virus SH strain HUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1, ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13 (1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture , Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Science and Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China ) Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1 K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence 伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057) 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @ njau 1edu 1cn 南京农业大学学报 2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity
抗HER2人源化单克隆抗体Herceptin的专利剖析供稿人：彭建新供稿时间：2004-12-30 关键字：HER2 单克隆抗体乳腺癌 乳腺癌严重地威胁着人们的健康，几乎所有人群的乳腺癌发病率都在上升，平均每年约升高1%，估计全球每年发病患者超过100万（cancer statistics 2002 cancer J Clin 2002,52(1):23）。 c-erbB2/ HER-2/ neu 编码产物p185erbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生 长因子受体(EGFR) 家族成员。C-erbB2/ HER-2/ neu 基因的扩增和p185erbB2蛋白的过度表 达见于多种恶性肿瘤,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺 癌。 p185erbB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。p185erbB2作为肿瘤 抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。美国食品及药物管理局( FDA) 已于1998 年10 月正式 批准将一株抗p185erbB2人源化抗体Trastuzumab （商品名Herceptin，Genentech/罗氏公 司）用于临床治疗p185erbB2高表达的转移性乳腺癌。 Genentech公司就Herceptin产品相关的专利申请了如下保护： （1）一种可与HER2受体胞外区特异性结合、抑制肿瘤细胞生长的单克隆抗体及该其在在治 疗过量表达HER2受体的癌症病人方面的应用。 （2）一种可与HER2受体胞外区特异性结合、使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性 因子更敏感的单克隆抗体。 （3）治疗过量表达HER2受体的癌症病人的方法，包括给上述患者服用有效量的细胞毒性因 子和能与HER2受体结合、使过量表达HER2受体的肿瘤细胞对细胞毒性因子更敏感的抗体， 以消除或减小患者的肿瘤。 （4）细胞毒性因子和抗体抗原结合残基在上述权利要求方面的应用。 Genentech公司就与Herceptin产品相关的技术已在美国、日本、加拿大申请了专利保护， 具体的专利为：JP3502885、US5677171、US5720937、US5720954、US5725856、US5770195、 US5772997、JP11255666、JP11335297、JP3040121、CA1341082、US6165464、US6387371、 US6399063、US2002192211。 Genentech公司就抗HER2抗体的最新专利申请为（2004年公开的，以Her2 or c-erbB2 or c-erbB-2 or p185作为主题词）：
K E X I N科昕生物 北京科昕生物科技有限公司 重组抗PD-1全人单克隆抗体(细胞培养级别) Recombinant anti-Human PD-1 Functional Monoclonal Antibody （Cell Culture Grade） 产品说明： PD1 全人单抗可以有效地封闭PDL1 和PD1 的结合，并且不会引起 HAMA 反应（人抗鼠抗体反应）。PD1 的抗体已作为广谱性抗肿瘤药物被接受，也可能成为最有效地平衡细胞治疗的工具。PD1 是激活的T细胞、B 细胞以及髓样细胞膜表面重要的免疫调控受体。与配体PDL1和PDL2 结合，抑制T 细胞增殖和细胞因子分泌，影响细胞治疗的效果。近来研究发现，DC 细胞含有PDL1，DC‐CIK 联合治疗时，PDL1 可能是潜在的细胞治疗的负调节因素。PD‐1 主要在活化的T、B 和NK 等细胞上呈诱导性表达,PD‐1 有PD‐L1(B7‐H1,CD274)和PD‐L2(B7‐DC,CD273)两个配体。PD‐L1 广泛组成性表达于多种实质器官组织、免疫细胞以及多种类型的肿瘤细胞上,而PD‐L2 仅表达于活化的巨噬细胞、树突状细胞、骨髓来源的基质细胞和个别肿瘤细胞株。PD‐1 随T 细胞活化程度逐步上调表达,与PD‐L 结合后引发抑制信号的产生，致使效应性T 细胞失能并及时进入凋亡。 本产品系由单克隆细胞株表达并高度纯化后的抗体经超滤换液分装制成。 本产品为无菌澄明液体，由含有 10mM PBS pH为 7.2的蛋白溶液经0.2um过滤后分装。 规格参数： 货号：kx10-1 体积：50ul/500ul/1ml 浓度：1mg/ml. 质量控制： 纯度：经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS-PAGE检测，纯度大于98.0%. 内毒素：小于1EU/mg. 使用说明： 建议长期-80℃分装保存，无菌条件下操作，避免污染。 具体用量需通过预实验确定。 1
V IROLOGICA S INICA, August 2007, 22 (4):316-325 Received: 2007-04-04, Accepted: 2007-05-18 * Foundation item: Key technologies R&D program (2006BAD06A01) from the Ministry of Science and Technology of China. ** Corresponding author. Tel: +86-27-87199239, E-mail: wanghz@https://www.doczj.com/doc/6d15446493.html,
ZHUAN et al. Rapid Construction of Recombinant Viruses of PRV Genome 317 functional domains within the proteins (9). Such studies often require establishment of large numbers of recombinant viruses which are usually created by homologous recombination in infected cells relying on the cellular recombination and repair machinery. However, this can be a laborious and sometimes impossible task, especially if the mutant has a severe growth disadvantage compared to the wild-type virus. Bacterial artificial chromosomes (BACs), single copy F-factor-based plasmid vectors of intermediate insert capacity (15), have now enabled the cloning of complete herpesvirus genomes and infectious virus genomes can be shuttled between Escherichia coli (E. coli) and eukaryotic cells. While herpesvirus BAC DNA engineering in E. coli requires neither restriction sites nor cloning steps and allows the introduction of a wide variety of DNA modif- cations, the large size of these bacmids precludes the use of rapid in vitro methods of manipulation commonly employed for construction of small plasmids. Tn7, a site-specific transposon, transposes almost exclusively to a distinct attachment site named attTn7 within the E. coli genome (1). By introducing this attTn7 sequence into a BAC, Tn7 can serve as an insertion vehicle (4). This is particularly useful if numerous genes and constructs need to be tested for their expression in the context of viral genome. Tn7-mediated transposition has been well exploited for research on functional genomics of baculoviruses (4). Recently, this technology has been applied to bacmid-cloned cytomegalovirus (CMV), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, for rapid recombinant virus construction (2). In this paper, we report the development of a technology employing Tn7-mediated transposition as a rapid and reliable method for recombinant PRV construction. A lacZα-mini-attTn7 region was inserted into the intergenic region between the gG and gD genes in an attempt to maintain every gene and element of the parental virus. Then green fluorescent protein (GFP) gene was introduced to test the utility of this transposition system and the stability of mini-Tn7 insertions in cell culture. The technology should greatly facilitate the detailed mutagenic studies of PRV. MATERIALS AND METHODS Plasmids, strains, and reagents Plasmids pGS284 and pBecker3, strains GS500 and S17λπ were provided by Lynn W. Enquist, Princeton University, USA. The pGEM-T Easy was purchased from Promega Co. (Maddison, USA), and plasmid pEGFP-N1 from Clonetech Laboratories, Inc. (Mountain View, USA). DNA restriction enzymes, T4 DNA ligase, alkaline phosphatase, exTaq hot start DNA polymerase and 2×GC buffer I were the products of TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, China). Plasmids pFBCMV-GFP and pZFBΔtk were constructed and stored in our lab. Strains DH5α and DH10B were stored in our lab. Lipofectin reagent and Delbecco’s Modified Essential Medium (DMEM) were purchased from Invitrogen Co. (Carlsbad, USA), and fetal bovine serum (FBS) from Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd. (Hangzhou, China). Virus and cells The wild-type PRV used was vBecker3, generated by transfection of pBecker3 into Vero cells (18). Mutant PRVs (vBeckerZF1 and vBeckerZF2) were
扑伪佳 产品简介： 通用名：猪伪狂犬病活疫苗（Bucharest 株） 商品名：扑伪佳?（PR–Vac Plus?） 英文名：Pseudorabies Vaccine, Modified Live Virus（Bucharest Strain） 汉语拼音：Zhu Weikuangquanbing Houyimiao（Bucharest Zhu） 产品说明书： 【主要成分与含量】疫苗中含有猪伪狂犬病毒（Bucharest 株）至少104TCID50/头份 【性状】本品为微黄色海绵状疏松团块，加稀释液后迅速溶解 【作用与用途】用于预防猪伪狂犬病 【用法与用量】3周龄以上猪，肌肉注射。按瓶签注明头份，用专用稀释液进行稀释，每头猪接种1头份（2ml） 推荐接种程序： -基础接种：在3周龄或3周龄以上时进行。对于免疫母猪所产仔猪，应在母源抗体下降后（约8-12周龄时）进行 -加强接种：对于种猪，每半年加强接种1次。对于怀孕母猪，可在怀孕40日后进行加强接种 【不良反应】接种后可能引起过敏反应，若发生这种情况，可用肾上腺素进行抢救，并采取辅助治疗措施 【注意事项】 1、仅用于接种健康猪 2、疫苗不要冻结 3、疫苗瓶开封后应一次用完 4、使用过的疫苗瓶和未用完的疫苗应焚毁 5、接种时，应执行常规的无菌操作 6、疫苗中含有庆大霉素 7、屠宰前21日禁止使用 8、如果动物处于某些传染性疾病的潜伏期、营养不良、有寄生虫感染、处于运输或环境应激状态下或存在免疫抑制，或者未按说明书进行接种，均可能引起免疫失败 【规格】10 头份（20ml）/瓶、25 头份（50ml）/瓶、50 头份(100ml)/瓶 【包装】10 盒/箱 【贮藏与有效期】在2～8℃保存，有效期为1 年6个月。
狂犬病防治手册 1．为何要停止生产含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗？ 研究发现，含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗较无佐剂狂犬病疫苗免疫人体后中和抗体的产生晚7天左右。狂犬病疫苗的暴露后免疫是一种应急使用，抗体的产生越早越好。因此，氢氧化铝佐剂对狂犬病的暴露后治疗十分不利。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。狂犬病疫苗中的的氢氧化铝佐剂同样可以导致不良反应增多。因此，2004年12月的人用狂犬病疫苗质量工作会议上，国家食品药品管理局已要求各生产企业在2005年6月30日前停止氢氧化铝佐剂人用狂犬病疫苗的生产。 2．为什么人用纯化狂犬病疫苗禁止臂部肌肉注射？ 因为臂部脂肪较多，疫苗注射后不易扩散，可能会影响免疫效果。因此，要求成人在上臂三角肌注射，儿童最好选择大腿前外侧区肌肉注射。 3．正在接种其它疫苗，是否可以注射狂犬病疫苗？ 正在接种其它疫苗，仍可注射狂犬病疫苗，但接种部位应远离前一种疫苗的接种部位。 4．使用疫苗的同时使用抗生素，会影响疫苗的效果？ 二者同时应用不会影响疫苗的效果。 5．年幼儿童注射疫苗为什么选择大腿前外侧？ 因为臂部肌肉脂肪较多，疫苗注射后不易扩散。上臂三角肌不发达，会影响疫苗的吸收。大腿前内侧因有大血管和神经经过，在此接种易发生危险。所以，年幼儿童应在大腿前外侧区肌肉注射，这里肌肉丰厚，易接种。
6．狂犬病病毒从感染至发病有哪些步骤？ 狂犬病病毒从感染到发病的步骤为：①病毒感染；②病毒在肌肉内复制；③病毒在神经肌肉结合处，与乙酰胆碱受体结合；④病毒通过快速轴突传递方式在周围神经的轴突内传播；⑤在脊髓的神经元与局部的周围感觉（背根）神经节内复制并快速上行到脑；⑥脑部神经元感染伴发神经功能障碍；⑦沿神经离心扩散到唾液腺、皮肤、角膜以及其他器官。 7．狂犬病病毒是如何与神经细胞相互作用的？ 狂犬病病毒与神经细胞的相互作用分四个阶段：①吸附：狂犬病病毒吸附于健康的神经细胞；②侵入：病毒被细胞吸入，进入细胞内；③复制：在细胞内，病毒迅速繁殖；④出芽：新的狂犬病病毒离开宿主细胞，吸附于其他神经细胞。然后，病毒从脑通过神经扩散到身体的其他器官。 8．狂犬病病毒的特性有哪些？ 狂犬病病毒是嗜神经性病毒，对神经组织有特殊亲和力。病毒不能穿透健康皮肤，主要通过损伤皮肤和粘膜入侵，少数由呼吸道吸入感染。病毒侵入后，沿传入神经到达中枢神经，侵害中枢神经细胞，然后再由中枢沿传出神经侵入各脏器组织，如唾液腺、眼、舌、皮肤、心脏等。因唾液腺最适狂犬病病毒繁殖，故唾液中含病毒最多，早在症状出现前14天即有病毒出现。因此唾液为主要传染源，既可通过舔咬感染人和畜，又可通过流涎污染环境，引起吸入性感染。 9．狂犬病的病原体是什么？ 狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。 10．曾经注射过狂犬疫苗的人又被犬咬伤还用再打针吗？ 全程接种符合效价标准的疫苗后1年内再次被动物致伤者，应于0和3天各接种一剂疫苗；在1-3年内再次被动物致伤，且已进行过上述处置者，应于0、3、7天各接种一剂疫苗；超过3年者应接种全程疫苗。此外，对暴露前后所用的疫苗效价无法证实者及免疫回忆应答无法确认者仍应进行全程免疫。
猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理 最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。 那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？ （一）综述 猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。 本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死
亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。 （三）病理变化 剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。 （四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。
人源化单克隆抗体的构建技术 摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。 关键词：人源化，单克隆抗体，构建 从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1]，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性，成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。 人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。 1 嵌合抗体的构建 抗体分子与抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910244928.7 (22)申请日 2019.03.28 (71)申请人 中国科学院武汉物理与数学研究所 地址 430071 湖北省武汉市武昌区小洪山 西30号 (72)发明人 贾凡 徐富强 李莉 缪欢 吕培 施祥玮 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 35/76(2015.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环 路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种高亮表达红色荧光蛋白 的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备 方法和应用，包括（1）制备表达红色荧光蛋白的 重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用， 该平台成功制备高亮表达红色荧光蛋白的重组 伪狂犬病毒。本发明成功获得高亮表达红色荧光 蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，在 神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制 病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动 物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方 面具有广泛的应用价值。 权利要求书1页 说明书5页序列表8页 附图2页CN 109943539 A 2019.06.28 C N 109943539 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109943539 A 1.一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤： 1)具备高亮表达红色荧光蛋白能力的克隆：以pCDNA3.1(+)为载体，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA； 2)构建高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA；将SEQ ID NO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA-right arm；将所得的质粒转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养基上清；纯化后即获得高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。 2.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。 3.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。 4.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。 5.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。 6.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。 2
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。 1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白
实践Practice 文 ⊙ 周远成 畜禽生物制品四川省重点实验室 张 冰 四川华神兽用生物制品有限公司 李 碧 四川农业大学动物医学院 2011年至今，全国范围内的猪伪狂犬病暴发后，国内学者分离到大量新毒株，如HeN1及TJ株。基因组分析结果表明，新毒株与以往分离的PRV毒株相比存在转换、插入和缺失变异的特点。实验结果证实SA215对伪狂犬病经典毒株和新流行毒株均具有优异的免疫保护能力，能有效保护猪只免受猪伪狂犬病野毒的感染。 猪伪狂犬病活疫苗（SA215株，扑伪优） 对新流行伪狂犬病病毒具有良好的免疫保护力 2011年底河南、山东等地先后暴发猪伪狂犬病，随后迅速扩散至我国主要生猪养殖区域，给养猪业造成了巨大的经济损失。为了研究猪伪狂犬病活疫苗（SA215株）对新流行猪伪狂犬病病毒的免疫效力，本研究对猪伪狂犬病活疫苗SA215株和新流行伪狂犬病野毒株的主要免疫保护相关基因进行遗传进化分析，使用断奶仔猪模型评价猪伪狂犬病活疫苗SA215株对猪伪狂犬病病毒和新流行毒株的免疫效力。结果显示，猪伪狂犬病病活疫苗SA215株与流行毒株均为基因II型毒株，而我国广泛使用的疫苗毒株Bartha株则为基因I型。使用SA215株免疫仔猪后1周即可检测到gB抗体，免疫后4周分别使用流行毒株SCHS株和经典毒株Fa攻毒，结果显示，未免疫攻毒的对照组全部发病、死亡，而免疫组未观察到伪狂犬病的临床症状。 伪狂犬病病毒（Psudorabies Virus，PRV）为疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双股DNA，核酸长度约150kb。PRV可感染多种动物（35种以上），以发热、奇痒（猪除外）、繁殖障碍、呼吸道症状和脑脊髓炎为特征。猪是PRV最主要的天然宿主，PRV感染后的临床症状与猪的年龄、免疫状态以及毒株毒力密切相关，通常情况下易感猪群年龄越小感染后发病率和死亡率越高。PRV可以在神经细胞内复制并沿神经通路传导，猪感染恢复后PRV可以潜伏在三叉神经节中而不被机体清除，在猪免疫力下降或环境应激条件下，潜伏的PRV可被激活持续在猪体 内复制并排出病毒。目前欧美发达国家已经成功根除该病，而PRV一直在我国猪群中流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。 2011年底，猪伪狂犬病首先在我国北方地区暴发，以繁殖障碍和育肥猪gE抗体快速转阳为主要特征。国内科研院所在疾病暴发后对该病进行了大量的研究，先后分离到多个新毒株，如HNX、ZJ01、HeN1、SMX、TJ、JS、HN1201、XJ、FJ和SCHS株等。进一步研究发现，新毒株可感染Bartha免疫猪群并造成严重的经济损失；新流行毒株传播能力强于经典野毒株，在某些猪场种猪或育肥猪gE抗体阳性率甚至达到100%。遗传进化研究结果显示，新流行毒株均为基因II型毒株，而我国广泛使用的疫苗株Bartha株则为基因Ⅰ型毒株。 疫苗免疫是防控猪伪狂犬病最经济的方法。猪伪狂犬病活疫苗SA215株是我国第一个具有完全自主知识产权的动物病毒基因工程活疫苗，开创了我国动物病毒基因工程疫苗实用化的先例。运用基因工程技术，SA215缺失了亲本毒Fa的主要毒力基因gE、gI、TK。经过生物学特性、免疫原性、遗传稳定性和安全性试验等一系列研究证实，SA215株在防控猪伪狂犬病上具有免疫原性好、安全性高、能阻止强毒入侵中枢神经等优势，可区分疫苗和野毒感染。为评价猪伪狂犬病活疫苗SA215株对新流行毒株的免疫保护效力，本研究通过遗传进化分析和免疫效力测试发现SA215与我国当 防控
狂犬病毒的作用原理？是对人的神经起作用还是？ 狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。 [病原学] 狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。 狂犬病毒易被紫外线、甲醛、50～70%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经56℃30～60分钟或100℃2分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年。 [流行病学] 狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，发病率明显下降。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。 （一）传染源发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占80～90%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性。 （二）传播途径主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。 （三）传播途径人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。 [发病机理与病理变化] 狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：①局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约4～6日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。②从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。③向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/6d15446493.html, 伪狂犬病概述 作者：潘余乐 来源：《国外畜牧学·猪与禽》2015年第08期 伪狂犬病是一种急性、高致死性疾病，广泛分布在世界各地，主要感染猪和其他家畜，偶尔会感染野生动物。自20世纪60年代以来，伪狂犬病毒在美国已经成为一个重要的病原体，可能是因为在分娩猪舍的发病增加，或因为有毒力更强的毒株出现。猪以外动物的临床症状类似于狂犬病的症状，因此得名“疯痒”（但猪不表现出这种症状）。伪狂犬病是一种需向政府相关部门报告的疾病，并已成功地从美国绝大多数地区根除。 1 病因 伪狂犬病毒是一类DNA疱疹病毒。猪是该病毒的唯一宿主，但病毒可以感染牛、羊、猫、狗和山羊，以及野生动物，包括浣熊、负鼠、臭鼬和啮齿动物。在灵长类动物上进行的实验研究表明，恒河猴和狨猴易感染，但黑猩猩不易感染。人感染伪狂犬病毒的报告很有限，且基于血清转化而不是病毒分离得出的结果。马感染狂犬病毒的病例很罕见。目前伪狂犬病毒只有一个血清型，但使用单克隆抗体制备物、限制性内切酶测定法以及胰蛋白酶灭活标记法可以鉴别出毒株的差异。 2 流行病学 伪狂犬病毒可通过鼻-鼻或粪-口途径传播。间接传染一般通过吸入雾化的病毒后发生传播。传染性病毒可在相对湿度≥55 %的空气中存活长达7 h。来自英国的研究数据表明，在特定的气候条件下病毒可以通过气溶剂传播到2 km以外的地方。其他研究证明，该病毒可在无氯井水中生存长达7 h；在厌氧的湖泊水、青草、土壤、粪便和去皮的玉米中生存2 d，在塑料瓶中的鼻腔洗涤液和猪颗粒饲料中存活3 d，在稻草类垫料中存活 4 d。伪狂犬病毒外有包膜，因此干燥、阳光和高温[≥37 ℃（98.6 ℉）]可使其失活。濒死宿主，如狗、猫、野生动物，可以在农场之间传播病毒，但这些动物在感染后只能存活2 d～3 d。昆虫作为病毒传播载体的潜在作用正在调查中。鸟类在病毒的传播中似乎并无作用。 3 临床症状和发病机理 猪的临床症状取决于受感染猪的年龄。幼龄的猪高度易感，且日龄低于7 d的仔猪死亡会达到100 %。一般情况下，幼龄猪感染后中枢神经系统症状（例如颤动和摇晃）很容易出现。如果断奶仔猪受到感染，呼吸系统疾病是主要的临床症状，特别是并发感染致病性细菌后症状将复杂化。据报道，伪狂犬病毒能够抑制肺泡巨噬细胞的功能，因此病毒会降低这些细胞处理和破坏病毒的能力。全身性发热[41 ℃～42 ℃（105.8 ℉～107.6 ℉）]、厌食和体重减轻可见于各年龄段受感染的猪上。生长和肥育猪的死亡率非常低（1 %～2 %），但保育猪的死亡率 可能达到50 %。打喷嚏和呼吸困难很常见，偶尔有报道可见到中枢神经系统疾病。在非猪的