蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。
以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。
2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。
3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。
4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。
5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。
6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。
蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。 以下是一些常见的蛋白质层析技术： 1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**： - 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。 2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**： - 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。 3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**： - 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。 4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**： - 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。 5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**： - 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。 6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**： - 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。
浅谈凝胶柱层析分离蛋白质 根据对生物产物分离工程的学习及所做的相关实验，我对这方面的知识有了粗浅的认识。根据所学知识我发现生物产物分离的方法多种多样，不同产物其分离方法不同，同种产物又有多种分离方法。就所做的实验而言，我对层析法分离蛋白比较感兴趣。以下是我对这种方法的了解： 层析法是分离蛋白质通用的方法。其原理都是通过蛋白质在流动相和固定相之间的性质不同而达到分离的效果。层析法可分为纸层析法，凝胶过滤层析法，离子交换层析法等。凝胶过滤层析法最为常用，在分离蛋白质时只需要把蛋白质混合液加到凝胶珠的上部，并加少许洗脱液来产生一定的液压是蛋白质能向下运动，在凝胶柱底部用试管接流下来的蛋白质液体，进行比色。此种方法很简单，不需要贵重仪器，但分离的蛋白质不是很好，这些液体仍然是很多蛋白质的混合液，通过比色来确定目的蛋白含量的最高值。这种方法只能对蛋白质进行一些粗筛。 近期做了一个实验应用到了凝胶层析即凝胶柱层析分离蛋白质，这个实验主要是运用凝胶层析分离蓝色葡聚糖2000kb和牛徐清蛋白的。这个实验应注意：1、装柱时要注意凝胶的流速，不宜过快，同时要保证凝胶能充分的沉淀且分布的比较均匀; 2、凝胶溶胀所用的溶液应与洗脱用的溶液相同，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果; 3、样品的浓度和加样量的多少。是影响分离效果的重要因素。样品浓度应适当大，但大分子物质的浓度大时，溶液的黏度也随之变大，会影响分离效果，要兼顾浓度与黏度两方面。加样量和加样体积越少分离效果越好，加样量一般为柱床体积的1%-2%，制备用量一般为柱床体积的20%-30%；4、凝胶用完后可再加入防腐剂低温保存；5、叠氮钠属于
葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质 实验简介：凝胶层析法是用一般的柱层析法使分子量不同的溶质通过具有分子筛效应的介质(如葡聚糖凝胶)，从而达到分离提纯的目的。凝胶层析设备简单，操作简便，条件温和，已成为分离分析蛋白质等生物大分子不可缺少的实验手段。 一、实验目的 1、掌握葡聚糖凝胶柱层析法的工作原理及基本操作技术。 2、掌握蛋白质分离纯化的一般操作技术。 二、实验原理 凝胶层析是按溶质分子大小不同而进行分离的一种层析技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验采用葡聚糖凝胶G-50作为固相载体，它适用于相对分子质量范围在1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。当蓝色葡聚糖-2000(相对分子质量在200万以上，蓝色)，细胞色素C(相对分子质量12800，红色)和重铬酸钾(相对分子质量294，黄色)的混合物流经层析柱时，三种物质的分级分离明显可见。蓝色葡聚糖因完全被排阻在凝胶颗粒之外而首先流出，细胞色素C渗入凝胶颗粒内部而其次流出，重铬酸钾则完全渗入凝胶内部最后流出。通过作洗脱曲线便可清楚地表示出葡聚糖凝胶G-50对这三种物质的分离效果。 样品中的各组分的流出顺序，可用有效分配系数K av表示： K av =(V e-V o)/(V t -V o) 上式中，K av指的是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔径的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。 外水体积V o(outer volume)指基质颗粒之间体积的总和； 内水体积V i(inner volume)指基质颗粒内部体积的总和； 基质体积(V g)指基质自身所具有的体积。V。、V i和V g都是随着床体积和基质性质变化而变化的； 洗脱体积V e(elution volume)指从加样到柱出现最大浓度(峰)时所流过的洗脱液的体积(如图1)。 床体积V t(total volume)指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积。V t是基质的外水体积(V o)和内水体积(V i)以及基质体积(V g)的总和(如图2)。 即：V t=V o+V i+V g=V o+V i
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法 一、实验目的 1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。 2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即： Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
离子交换层析技术 层析（chromatography）也称为色谱，就是将混合物中各种组分分离的方法，是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相，即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时，由于各组分在两相之间的分配比例不同，它们（各组分）就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相可以是固体，也可以是被固体或凝胶所支持的液体。定相可以被装入柱中或涂成薄层、薄膜，成为层析“床”。动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气相层析，或者成为液相层析。 离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以待分离的样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为α球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。
凝胶层析法分离蛋白质实验报告 实验目的： 通过凝胶层析法对不同分子量的蛋白质进行分离纯化，掌握凝胶层析的基本原理和操作方法，并熟悉蛋白质纯化过程中的注意事项和常见问题。 实验原理： 凝胶层析法是一种蛋白质纯化方法，其基本原理是利用凝胶的三维结构和孔径大小对不同分子量的蛋白质进行分离纯化。常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、硅胶凝胶等。 在实验中我们采用了聚丙烯酰胺凝胶，其孔径大小是可以控制的，所以利用不同孔径大小的凝胶对不同分子量的蛋白质进行分离。通常，具有较大分子量的蛋白质被排除在凝胶顶端的孔径较小的区域，而具有较小分子量的蛋白质则可以渗透入较小孔径的凝胶中，因此存在于较深的凝胶层中。 实验步骤： 1.准备干燥的聚丙烯酰胺凝胶片，并将其装入凝胶层析柱中。 2.通过密封顶部的小孔，加入显色剂和柠檬酸盐缓冲液制成试样，注意不要将试样直接滴入凝胶中。 3.将制备好的样品通过重力作用，缓慢流经凝胶柱，待所有样品渗透完毕后，收集洗脱出来的蛋白质。 4.将收集得到的蛋白质样品通过SDS-PAGE电泳分析其分子量和纯度。 实验结果： 在本次实验中，我们以三种分子量不同的蛋白质作为样品，分别是Bovine Serum Albumin（分子量为66kDa）、Egg Albumin（分子量为44kDa）以及Cytochrome C（分子量为12.4kDa）。 结果显示，我们的分离纯化效果较好，三个分子量不同的蛋白质在凝胶中得到了良好的分离。而通过SDS-PAGE电泳也证实了每个样品的分子量与预期相符，并且纯度较高。 1.凝胶层析柱和样品的pH值要一致，避免蛋白质发生脱变性。 2.样品加入凝胶层析柱后，立即加入缓冲液，避免样品直接流入凝胶中。
蛋白质分离原理及方法 蛋白质是生物体内重要的有机分子，具有多种功能，如酶催化、传递信号、结构支持等。研究蛋白质的结构和功能对于理解生物体的生命活动具有重要意义。而要研究蛋白质，首先要进行蛋白质的分离。本文将介绍蛋白质分离的原理和方法。 一、蛋白质分离的原理 蛋白质分离的原理是基于蛋白质的性质差异进行分离。蛋白质的性质差异主要包括大小、电荷和亲疏水性等方面。根据这些差异，可以利用不同的分离方法将蛋白质分离出来。 二、蛋白质分离的方法 1. 凝胶电泳法 凝胶电泳法是一种常用的蛋白质分离方法。根据蛋白质的电荷差异和大小差异，将蛋白质分离在凝胶上。常用的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。其中，SDS-PAGE可以将蛋白质按照分子量大小分离出来，而PAGE可以将蛋白质按照电荷差异分离出来。 2. 柱层析法 柱层析法是一种根据蛋白质的亲疏水性进行分离的方法。常用的柱层析方法有离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。离子交换层析是利用离子交换剂的电荷与蛋白质的电荷相互作用，将蛋白质
分离出来。凝胶过滤层析则是根据蛋白质的大小差异将蛋白质分离出来。亲和层析是利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合，将蛋白质分离出来。 3. 离心法 离心法是一种根据蛋白质的大小差异进行分离的方法。通过调整离心速度和时间，可以将不同大小的蛋白质沉淀在不同位置，从而进行分离。常用的离心方法有差速离心和密度梯度离心等。 4. 薄层析法 薄层析法是一种简便快速的蛋白质分离方法。将待分离的蛋白质样品涂在薄层析板上，然后将薄层析板浸入移液池中，利用毛细作用将样品分离出来。常用的薄层析方法有等电聚焦薄层析和亲和薄层析等。 5. 免疫学方法 免疫学方法是利用抗体与抗原的特异性结合进行蛋白质分离的方法。通过将待分离的蛋白质与特异性抗体结合，然后利用抗体对蛋白质的识别，将蛋白质分离出来。常用的免疫学方法有免疫沉淀和免疫层析等。 蛋白质分离的原理是基于蛋白质的性质差异进行分离，常用的分离方法有凝胶电泳法、柱层析法、离心法、薄层析法和免疫学方法等。这些方法可以根据蛋白质的大小、电荷和亲疏水性等特性，将蛋白
蛋白层析的性能特点及其工作原理介绍蛋白层析是一个快速分别肽、核酸、蛋白和自然产物的全 新液相色谱系统，其配套的色谱柱和方法模板可以进行凝胶过滤、 离子交换、疏水层析、反向层析和亲和层析，适合从一般科研检验 到药品质检或临床分析应用。可以操作各种层析技术，适合分别和 纯化各种生物分子，包括自然蛋白质，重组和融合蛋白质、肽、 寡核苷酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等等，适合操作肽图等精 确分析和小量制备应用。能够快速完成纯化生物分子蛋白质、核酸、肽等，一机完成从试验室基础讨论到整个工艺方法快速开发及放大。可以进行生物大分子的范例纯化,已知和未知蛋白质的纯化，可以检测、分别、纯化多种生物样品，能够有效地针对植物、动物、人类 生物体等各种样品，检测、纯化、分别特异性生物小分子。 蛋白层析纯化系统的五大特点： 1、操作简便，所需设备简洁。有时只要有一根层析柱便可进 行工作。分别介质凝胶*不需要像离子交换剂那样简单的再生过程便 可重复使用。 2、分别效果较好，重复性高。突出的是样品回收率高。 3、分别条件缓和。凝胶骨架亲水，分别过程又不涉及化学键 的变化，所以对分别物的活性没有不良影响。 4、应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分别纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分别的分子 量范围也很宽。
5、辨别率不高，分别操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子 量的不同作为分别依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上， 所以分别时流速必需严格把握。因而分别操作一般较慢。而且对于 分子量相差不多的物质难以达到很好的分别。此外，要求样品粘度 不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。 蛋白层析适用于分别和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶 床就可以*将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶 液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。它是生物分子纯化的抱负选择。它具有功能多、使用简便、经济等特点。小巧的设计限度地节省冷 库和试验室的工作空间。
蛋白质纯化与层析技术 蛋白质纯化是生物化学和生物技术领域中至关重要的过程，用于从混合物中分离和纯化目标蛋白质。层析技术作为蛋白质纯化的关键步骤之一，它不仅可以选择性地将目标蛋白质从混合物中分离出来，还可以去除杂质，获得高纯度的蛋白质样品。 一、蛋白质纯化的基本原理 蛋白质纯化的基本原理是根据不同的理化性质，如分子量、极性、电荷等特征，选择合适的纯化方法分离目标蛋白质。常见的蛋白质纯化方法包括离心、超滤、电泳、沉淀和层析等。 离心法是通过调整离心速度和时间，根据不同蛋白质的分子量和密度差异，将目标蛋白质和非目标蛋白质分层离心，进而实现纯化。超滤法则是利用滤膜对溶液进行筛选分离，减少蛋白质和其他分子之间的尺寸和质量差异，从而实现蛋白质的纯化。 电泳法是根据蛋白质在电场中不同的电荷和分子量特性，使其在凝胶上移动的速度不同，从而实现纯化和分离。沉淀法则是通过添加适当的沉淀剂，使蛋白质凝聚成颗粒，经过离心后分离出来。而层析法是根据蛋白质与层析介质之间的相互作用，通过选择性吸附和洗脱，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。 二、层析技术的分类与原理
层析技术是在纯化过程中广泛使用的方法，根据不同的工作原理和 介质特性，可以将其分为几种不同的类型。常见的层析技术包括吸附 层析、凝胶层析、亲和层析和离子交换层析等。 吸附层析是通过目标蛋白质与特定层析介质之间的亲和力，使目标 蛋白质被吸附在介质上，从而实现纯化。凝胶层析则是利用介质中多 孔性凝胶矩阵的分子筛效应，根据蛋白质的分子量和形状特征，通过 不同的渗透效应将目标蛋白质分离出来。 亲和层析是利用目标蛋白质与特定配体（如抗体）之间的特异性结合，使目标蛋白质选择性地与介质上的配体结合，从而实现纯化。离 子交换层析则是基于蛋白质表面的电荷特性，通过电荷间的相互作用，使目标蛋白质与介质表面的离子互相吸附和洗脱，实现纯化。 三、层析技术的操作步骤和优化 层析技术的操作步骤通常包括前处理、样品加载、洗脱和再生等步骤。前处理包括调整样品的pH值、加入缓冲溶液和去除杂质等，以便 提高纯化效果。样品加载是将经过前处理的样品加载到层析柱中，使 目标蛋白质与介质发生相互作用。洗脱是通过调整洗脱缓冲溶液的条件，使目标蛋白质从层析柱中洗脱下来。再生是指对介质进行再生和 重复利用的操作。 在层析技术的操作中，需要对各个步骤进行优化，以提高纯化效果 和纯化产率。例如，在前处理过程中，可以通过调整pH值、离子浓度 和温度等条件，优化样品的特异性结合和非特异性结合。在样品加载 和洗脱过程中，可以根据目标蛋白质与介质之间的相互作用类型，选
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤 原理 在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。 疏水相互作用介质 苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5 辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3 溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕m1)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。 材料与仪器 蛋白质样品液 苯基琼脂糖C1-4BNaC1硫酸铉磷酸钠盐 层析柱 步骤 下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。 1.装填5m1苯基琼脂糖C1-4B进入柱内； 2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmo1∕1,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱； 3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。上样总蛋白量200-500mg； 4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线； 5.用分步梯度法洗脱。每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱； 6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mo1/1NaC1和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.了解凝胶层析的原理及其应用。 2.通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。 3.了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。 二、实验原理 （一）蛋白质分子量的测定 蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 近年来已成为生命科学领域的研究热点[1]。分子量是蛋白质的主要特征参数之一, 当发现一种新的蛋白质时, 首先应准确测定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种, 如渗透压法、光散射法、超速离心法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等[2-4]。 （二）凝胶层析法 层析法，又称色层分析法或色谱法（Chromatography），在1903-1906年由俄国植物学家M.Tswett首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确度也为各种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层析等方法[5]。 凝胶层析法（gel filtration），又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法 (GPC )、排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法（molecular sieve chromatography）等[6]，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。 凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 由于其分离条件温和、样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等特点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中 最简单、条件最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。虽
层析技术在蛋白质纯化中的应用 概述 一．层析技术的基本原理 各种层析法虽然实验机理和实验方法大相径庭，但基本原理却都一样。即在所有的层析法中，均存在固定相和流动相。 为了更方便阐明层析技术的基本原理，引入“有效分配系数”这一概念，这一概念指的是在一定的温度、压力和一定溶剂系统中，一种物质分配达到平衡时，物质在固定相中的总量与在流动相中的总量的比值。 层析技术的分离原理可用下图表示： 图一层析技术的分离原理 将1ml含有32ug的蛋白的样品加到柱子上面，占据了柱子的A位置，假定该蛋白的“有效分配系数”为1，则平衡后，该蛋白在固定相和流动相中的量均为16ug；有1ml流动相加到柱上，平衡后，有16ug的样品被带到B位置；再有1ml流动相加到柱上，B位置上的蛋白将有8ug到达C位置，而A位置上的蛋白也将有8ug带到B位置，就呈现出A位置8ug，B位置16ug，C位置8ug。依此类推，假定经过5次平衡后蛋白被分配到整个柱中，此时柱中的蛋白分配量为A位置2ug，B位置8 ug，C位置12 ug，D位置8 ug，E位置2 ug。这样在柱子中部就形成了一个浓度峰。如果该蛋白的有效分配系数大于1，则浓度峰在柱子中部以上；有效分配系数小于1，浓度峰在柱子中部以下。 当然，只经过5次平衡形成的浓度峰是比较平坦的，但不难想象，若经过成百上千次的平衡，那么浓度峰就将越来越尖锐，蛋白在柱子某一位置被富集起来，浓度越来越高，这就是层析技术的基本原理。 事实上，流动相是连续不断地加入到柱子上的，因此柱上的平衡是连续发生的，在一个正常工作的柱子上发生着上千次的平衡，所发生的平衡次数我们称为“理论塔板数”，“理论塔板数”越多，柱子的分离效果就越好。 为了提高层析的理论塔板系数，通常使用细长的层析柱；并尽可能的使用细颗粒的固定相，但过细的颗粒会影响流速；流动相经过固定相时的速度要慢一些，以使蛋白在两相中能够达到分配平衡。上样体积也应受到控制，上样体积越小，展开后形成的峰越集中，这也能提高分离效果。
凝胶层析法测定蛋白质分子质量 一、实验目的 1.了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。 2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数K av （分离化合物在内水和外水体积中 的比例关系）表示，K av 值的大小和凝胶柱床的总体积（V t ）、外水体积（V ）以 及分离物本身的洗脱体积（V e ）有关：K av =（V e -V ）/（V t -V ）。 在限定的层析条件下，V t 和V 都是恒定值，而V e 是随着分离物分子质量的变 化而改变。分子质量大，V e 值小，K av 值也小。反之，分子量小则V e 值大，K av 值 大。 有效分配系数K av 是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质
实验十七蛋白质分子量测定——凝胶过滤层析法 一、目的： （1）初步掌握利用凝胶层析法测定蛋白质分子量的原理。 （2）学习用标准蛋白质混合液制作V e，K av对1gM r的“选择曲线”以及测定未知蛋白质样品分子量的方法。 二、原理： 凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又叫做分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。分离过程中的示意见图17-1。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶，后者的商品名称为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它是个有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水，其化学结构式如图17-2所示。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。 为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t（total volume）表示。实际上V t是由V o，V i与V g三部分组成，即： V t=V o+V i+V g V o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体 积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相应于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t—V o等于V i+V g 。它们之间的关系可用图17-3表示。