蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序
蛋白质凝胶层析是一种常用的蛋白质分离纯化技术，其原理是利用凝胶层析柱中的凝胶颗粒与蛋白质之间的物理化学互作用实现蛋白质的分离和纯化。在蛋白质凝胶层析中，洗脱顺序是非常重要的，不同的洗脱顺序会对分离和纯化的效果产生明显的影响。下面将详细介绍几种常用的蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序。
一、离子交换层析
离子交换层析是一种利用离子交换树脂分离和纯化蛋白质的方法。在离子交换层析中，蛋白质与树脂之间的相互作用是通过蛋白质和树脂之间的电荷相互吸引而实现的。树脂表面带有固定电荷，蛋白质通常具有正电荷或负电荷，因此它们可以相互吸附在树脂上。洗脱时，通常采用逐渐增加或减少盐浓度的方法，通过改变离子强度来控制蛋白质的吸附与解吸，实现蛋白质的分离和纯化。
离子交换层析的洗脱顺序通常分为以下几步：
1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在树脂上的亲和物质和非特异性吸附物。
2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如组织碎片、细胞碎片和核酸等。
3. 分级洗脱：从低盐到高盐逐渐增加缓冲液中的离子浓度，根
据蛋白质的亲和性和亲和强度，逐渐洗脱目标蛋白质。
4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱树脂上的杂质和非特异性吸附物。
5. 平衡：用平衡缓冲液平衡层析柱，使其恢复初始的交换能力。
二、尺寸排阻层析
尺寸排阻层析是一种根据蛋白质的大小差异来分离和纯化蛋白质的方法。在尺寸排阻层析中，凝胶层析柱中的凝胶颗粒具有固定的孔径，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。因此，大分子蛋白质会流经凝胶颗粒，而小分子蛋白质会进入凝胶颗粒内部，实现二者的分离。
尺寸排阻层析的洗脱顺序通常分为以下几步：
1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在凝胶颗粒表面的亲和物质和非特异性吸附物。
2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如细胞碎片、核酸等。
3. 分级洗脱：从大孔径到小孔径逐渐减少缓冲液中的孔径，根据蛋白质的大小差异，逐渐洗脱目标蛋白质。
4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱凝
胶颗粒表面的杂质和非特异性吸附物。
5. 平衡：用平衡缓冲液平衡层析柱，使其恢复初始的尺寸排阻能力。
三、亲和层析
亲和层析是一种利用亲和剂与蛋白质之间的特异性相互作用来分离和纯化蛋白质的方法。在亲和层析中，亲和剂可以是某种化学结构与目标蛋白质相互作用的小分子，也可以是具有特定亲和结构的柱填充物。洗脱时，通常采用特定的洗脱缓冲液来打破亲和剂与蛋白质之间的特异性相互作用，实现蛋白质的分离和纯化。
亲和层析的洗脱顺序通常分为以下几步：
1. 预洗：用平衡缓冲液清洗层析柱，去除附着在柱填充物上的非特异性吸附物。
2. 去除杂质：使用低浓度的脱敏剂或其他特定缓冲液洗脱非特异性吸附物，如细胞碎片、核酸等。
3. 非特异洗脱：使用中等浓度的脱敏剂或其他特定缓冲液洗脱与亲和剂结合但非特异吸附的蛋白质。
4. 特异洗脱：使用高浓度的脱敏剂或其他特定缓冲液洗脱与亲和剂结合且特异吸附的蛋白质。
5. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高浓度的脱敏剂或其他特定缓冲液再次洗脱柱填充物上的杂质和非特异性吸附物。
以上是几种常用的蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序的详细介绍，洗脱顺序的选择应根据实际样品和目标蛋白质的特性来确定，合理的洗脱顺序可以提高分离和纯化的效果，提高纯化产率和纯度。同时，在进行蛋白质凝胶层析过程中，还需要注意优化各步骤的操作条件，如缓冲液pH值、温度、流速等，以保证实验结果的准确性和重复性。
凝胶色谱仪使用操作规程 一、基本理论 (一)分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。 两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙;二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙;三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。 对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。 (二)色谱柱的重要参数
反相硅胶键合相色谱柱的清洗 反相硅胶键合相一般包括C18 、C8 、C4 、苯基等，当用二元混合溶剂进行等强度洗脱时。为移去污染物，可用20 个体积的强洗脱溶剂，如甲醇、乙腈或四氢呋喃来冲洗柱子。如果流动相中含缓冲盐溶液，为防止有机溶剂清晰造成的盐析出，阻塞管路，应首先用20 个柱体积的不含缓冲盐的水- 有机相溶剂冲洗色谱柱，然后再用强洗脱溶剂清洗柱子。 如果用强洗脱溶剂仍不能驱除污染物，可以使用更强的溶剂或混合溶剂来洗脱。当需用一系列的有机溶剂清洗色谱柱时，应逐渐增加它们的洗脱强度，并确保溶剂之间的混溶性。对典型的反相硅胶柱，用于洗涤无缓冲盐的体系，推荐使用以下有机溶剂清洗系统：100 ％甲醇→100 ％乙腈→75 ％乙腈+25 ％异丙醇→100 ％异丙醇→100 ％四氢呋喃清洗后，按相反的顺序冲洗色谱柱，以返回到原始的流动相。如果使用者怀疑色谱柱被严重的污染或阻塞，可将二甲基亚砜与水或二甲基甲酰胺与水，以各自50 ％的比例混合，并以低于0.5mL/min 的流速通过色谱柱。 由于污染物聚集在色谱柱头，逆向冲洗会缩短污染物在柱中迁移的距离；又因为色谱柱皆在高于操作压力下填充的，通常逆向液流不会扰动色谱柱床。但如果色谱柱顶端过滤筛板的孔径大于柱底部过滤筛板的孔径，则固定相的微小粒子会在逆向冲洗过程通过筛板流出柱，从而会在柱中产生新的死空间引起柱床松动。因此在逆向冲洗前，应先确认柱管两端过滤筛板的孔径一致。 除盐：对普通反相C18 键合相柱，为除去柱中含有的缓冲盐类或水溶性物质时，不应使用纯水冲洗。因为C18 键合相像一条长链将硅胶黏结，当有有机溶剂存在时，其表面被流动相润湿，C18 长链完全展开，像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时，C18 键合相不能被浸润，键合相表面会塌陷，从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出，应使用含5 ％有机溶剂的水溶液冲洗，以清除无机盐或水溶性物质。 蛋白污染：如果需从硅胶键合固定相清洗蛋白质残留物，必须使用和前述不同的程序。如果生物材料血浆或血清样品注入色谱柱，在大多数情况下，纯有机溶剂( 如乙腈或甲醇) 并不能溶解肽和蛋白质，用它们清洗色谱柱是无效的。然而，有时使用有机溶剂与缓冲物、酸或离子对试剂的混合物却是有效的。 清洗反相柱中的蛋白质类物质，可使用表1 溶剂系统。 表1 从HPLC 反相柱中清洗蛋白质类物质使用的清洗溶剂系统 金属污染：有时清洗硅胶反相固定相需使用特殊的技术，如在早期硅胶键合相生产中，使用高金属氧化物含量的硅胶，金属离子会吸附在键合相表面，此时可使用0.05mol/ EDTA 冲洗，将金属离子螯合，再用纯水将可溶性螯合物洗掉。 清洗溶液 TSK-SW&SW XL系列色谱柱 1. PH较低（如：pH 3.0）、浓度较高的盐溶液（如：0.5M Na2SO4）； 2. 添加水溶性有机物（MeOH、ACN、EtOH，10% -20%）的极性缓冲液；
竭诚为您提供优质文档/双击可除凝胶层析分离混合蛋白实验报告 篇一：凝胶过滤法分离蛋白质实验报告 凝胶过滤法分离蛋白质 一、实验目的 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 二、实验原理 凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及 固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按
大到小的顺序流出实现分离的目的。 三、试剂与仪器 0.1mol/L磷酸缓冲液（ph7.0），0.4%K3Fe(cn)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血 1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒 四、实验步骤 1.凝胶溶胀 2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。 3.样品处理 4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm 处沿管内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。 5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色 篇二：生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法
一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。 二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提
蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序 蛋白质凝胶层析是一种常用的蛋白质分离纯化技术，其原理是利用凝胶层析柱中的凝胶颗粒与蛋白质之间的物理化学互作用实现蛋白质的分离和纯化。在蛋白质凝胶层析中，洗脱顺序是非常重要的，不同的洗脱顺序会对分离和纯化的效果产生明显的影响。下面将详细介绍几种常用的蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序。 一、离子交换层析 离子交换层析是一种利用离子交换树脂分离和纯化蛋白质的方法。在离子交换层析中，蛋白质与树脂之间的相互作用是通过蛋白质和树脂之间的电荷相互吸引而实现的。树脂表面带有固定电荷，蛋白质通常具有正电荷或负电荷，因此它们可以相互吸附在树脂上。洗脱时，通常采用逐渐增加或减少盐浓度的方法，通过改变离子强度来控制蛋白质的吸附与解吸，实现蛋白质的分离和纯化。 离子交换层析的洗脱顺序通常分为以下几步： 1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在树脂上的亲和物质和非特异性吸附物。 2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如组织碎片、细胞碎片和核酸等。 3. 分级洗脱：从低盐到高盐逐渐增加缓冲液中的离子浓度，根
据蛋白质的亲和性和亲和强度，逐渐洗脱目标蛋白质。 4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱树脂上的杂质和非特异性吸附物。 5. 平衡：用平衡缓冲液平衡层析柱，使其恢复初始的交换能力。 二、尺寸排阻层析 尺寸排阻层析是一种根据蛋白质的大小差异来分离和纯化蛋白质的方法。在尺寸排阻层析中，凝胶层析柱中的凝胶颗粒具有固定的孔径，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。因此，大分子蛋白质会流经凝胶颗粒，而小分子蛋白质会进入凝胶颗粒内部，实现二者的分离。 尺寸排阻层析的洗脱顺序通常分为以下几步： 1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在凝胶颗粒表面的亲和物质和非特异性吸附物。 2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如细胞碎片、核酸等。 3. 分级洗脱：从大孔径到小孔径逐渐减少缓冲液中的孔径，根据蛋白质的大小差异，逐渐洗脱目标蛋白质。 4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱凝
不同分子量蛋白质的分离——凝胶柱层析法 目的要求 （1）了解凝胶柱层析的原理及应用。 （2）掌握凝胶柱层析的基本操作技术。 实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（V o）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即： Kav= (Ve-V o)/(Vt-V o) 在限定的层析条件下，Vt和V o都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即V o）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。 试剂和器材 一、试剂 0.9％NaCl；10％NaHCO3）；95％乙醇。 pH 7.0凝酸缓冲液（20mM磷酸二氢钠：20mM磷酸氢二钠＝31mL：69mL） 二、材料 血红蛋白溶液（Hb）：取抗凝血（肝素）2mL，离心弃去上层血浆。用0.9％NaCl洗血细胞数次（颠倒混匀，离心，弃去上清液），使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀，离心去沉淀（破碎的细胞膜等）即为Hb稀释液备用。
凝胶过滤法分离蛋白质 一、实验目的 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 二、实验原理 凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。 三、试剂与仪器 0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血 1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒 四、实验步骤 1.凝胶溶胀 2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。 3.样品处理 4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。 5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。并观察柱上的色带，待黄色
的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。 6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。 五、实验现象结果及其讨论 颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。 原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。 2.红褐色慢慢变深，是因为分子的扩散有快有慢，少量的高铁血红蛋白与缓冲液一起滴出，使得溶液慢慢加深。 3.溶液变成深褐色，是过虑后，高铁血红蛋白的本色，颜色越深表明过虑后得到蛋白质越纯。 4.红褐色又开始变浅是因为大部分高铁蛋白已经洗脱下来，剩下少部分洗脱较慢的高铁蛋白，所以颜色又开始变浅。 5.开始呈现浅黄色，并又出现黄色，最后变成无色是因为高铁氰化钾的扩散快慢决定的，少部分扩散较快，接着大部分K3Fe(CN)6,洗脱出来，最后抗凝全血几乎洗脱完毕。试管接收的是缓冲液。 6.造成红褐色在前释出，接着才到黄色，其原因是：血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白，因为高铁血红蛋白的分子大，洗脱速度快而小分子的高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而造成红褐色在前洗脱出来，黄色在后。 六、思考题 1.利用凝胶层析后分离混合物时，怎样才能得到较好的分离效果？
实验三凝胶过滤法分离蛋白质 【实验目的】 了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。 【基本原理】 凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。 当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。 凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。 在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。 【实验试剂、材料和器材】 （一）试剂 （1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）： 称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。 （2）0.4% K3Fe（CN）6： 称取0.4g K3Fe（CN）6，溶于100mL蒸馏水中。 （3）生理盐水：0.85~0.9%氯化钠水溶液，置于冰箱中预冷。 （4）四氯化碳（CCl4） （5）交联葡聚糖（Sephadex-G-25） （二）材料 动物的抗凝全血 （三）器材 pH计，1.5cm×20cm的层析柱，电子天平，冰箱，试管，容量瓶，量筒，大烧杯，玻璃棒，胶头滴管等 【操作步骤】 1.凝胶溶胀
实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质 一、实验目的 1. 了解凝胶层析的原理及其应用。 2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。 Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。 K av是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的K av=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的K av=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤K av﹤1，在中间位置被洗脱。可见，K av 的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。 本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因K av值不同而被分离。 三、仪器与试剂 1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。 2.试剂 （1）标准蛋白 a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所） b.溶菌酶：Mw =14,300 （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液
实验三凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（0806）实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层 析分离菠萝蛋白酶 一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐 （一）目的和要求 掌握凝胶层析法的原理及操作技术。 （二）原理 凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。 凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子
将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。 下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯–2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/g干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～50通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。 （三）实验材料 （1）实验一所提的菠萝蛋白酶粗提样品
议凝胶色谱法分离蛋白质 摘要：凝胶色谱法是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。相对分子质量 较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子 质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短， 移动速度较快。具体过程包括：凝胶色谱柱的制作，凝胶色谱柱的装填，样品加 入和洗脱。要求我们谨慎操作才能成功得到移动均匀一致的蛋白质区带。 关键词：凝胶色谱法；凝胶；溶剂；凝胶色谱柱；分离度；洗脱 凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。 凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过 凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作 用容易进入凝胶内部的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过 程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的 网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。而相对分子质量较大 的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。分子量介于二者之间的物质，虽然能够进 入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的 速度比小分子快，而比大分子慢。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。具有多孔的凝胶又称分子筛。笔者主要从以下两方面来探讨凝胶色谱法，并结合 具体的例题来解析其具体的应用。 一、凝胶色谱法的分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，可分为凝胶过滤色 谱法和凝胶渗透色谱法。 凝胶过滤色谱法一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代 表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、 聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交 联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 二、凝胶色谱分离蛋白质的过程 1.凝胶色谱柱的制作 取长100cm，内直径2cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞打孔→挖出凹 穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。 其中层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般 制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。 分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高 的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分组分离 时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体 积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之比为20：1─100：1，常 用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。 注意事项： (1)底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼 龙网，还会导致液体残留，导致蛋白质分离不彻底。 (2)层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分
凝胶柱层析操作要点 (一) 基本原理 凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+ Vi 时出现洗脱峰。 (二)凝胶的类型及性质 1.交联葡聚糖凝胶 交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。在中性条件下，交联葡
凝胶层析法测定蛋白质分子质量 一、实验目的 1.了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。 2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、实验原理 凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。 凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数K av （分离化合物在内水和外水体积中 的比例关系）表示，K av 值的大小和凝胶柱床的总体积（V t ）、外水体积（V ）以 及分离物本身的洗脱体积（V e ）有关：K av =（V e -V ）/（V t -V ）。 在限定的层析条件下，V t 和V 都是恒定值，而V e 是随着分离物分子质量的变 化而改变。分子质量大，V e 值小，K av 值也小。反之，分子量小则V e 值大，K av 值 大。 有效分配系数K av 是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量，选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白质，应选 择更宽的凝胶，如sephacryls-300。对于分子量为3~5kda的蛋白质，应选择Sephadex G50或G25进行脱盐；对于低分子量多肽物质（1~5kda），应选择Sephadex G10或Sephadex G15进行脱盐。 ②凝胶介质的处理和装柱 商业明胶通常是干粉，在使用前用水膨胀。一般来说，1份明胶加10份水会自然膨胀至少24小时。膨胀后，从上清液中取出小凝胶，丢弃并再次搅拌。凝胶沉淀后，再次丢 弃凝胶碎片，重复几次，直到液相被清除。为了加速膨胀，可以将凝胶煮沸一小时，这种 方法同时具有杀菌效果。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1） 搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保 持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如 柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度 一致，以减少气泡的产生。③上样 凝胶过滤柱色谱法对样品的体积有严格的要求。样品体积不得超过柱床体积的1~5%。如果超过5%，分离效率将降低。如果低于1%，则分离效率不会提高。因此，蛋白质样品 应尽可能浓缩至10~20mg/ml。样品本身与洗脱液的相对粘度不得超过2。如果样品粘度过高，色谱区会不稳定，或流速不规则，色谱区会变宽或扭曲。加载前样品应通过0.2μm？用孔径滤膜过滤或用10000g离心机离心5min，以去除残留物。添加样品时，避免损坏色 谱柱表面，并保持其表面均匀平整。④ 洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结 合作用。sephadex和sepharosecl凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02mol/l；sephacryl凝胶应为0.05mol/l。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达0.2mol/l，以保证蛋 白质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤色谱中，洗脱速度是恒定的。流速不宜过高，一般为1ml/min左右。低流 速可提高分辨率。流量可由恒流泵控制。⑤ 分离蛋白质的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。⑥层析柱的再生与保 存 洗脱完成后，使用3-5柱床体积缓冲液清洗柱，以便再生凝胶。也可用0.2mol/lnaoh 或1mol/lnacl或非离子洗涤剂0.2~1%NP-40去除吸附过紧的杂质，然后用双蒸馏水充分
实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由V o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒
考点75 蛋白质的提取与分离 1．蛋白质提取与分离的依据 分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力。 2．凝胶色谱法 （1）材料：凝胶 多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （2）步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易 进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法 进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子 质量不同的蛋白质因此得以分离。 3．缓冲溶液 （1）概念：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 （2）作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。 （3）配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如 H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。 （4）本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4)，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH 环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。4．电泳法 （1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
（2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 （3）类型： 琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于 所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。 聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质 形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。 5．实验操作 实验操作的基本步骤：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 （一）样品处理 （1）红细胞的洗涤： ①目的：去除杂蛋白。 ②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。 ③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。 ④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。 ⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。 （2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 （3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。 试管中的溶液分为4层，从上往下依次是： ①无色透明的甲苯层。 ②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。 ③红色透明液体：血红蛋白溶液层。 ④暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。 （4）透析： ①方法：取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300 mL物质的量 浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12 h。 ②目的：去除样品中分子量较小的杂质。 ③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
第一章测试 1.利用限制性内切酶水解核酸后，通过比较水解后的片段差异，可以发现不同 样本之间的差异。这种方法可以用于什么检测？ A:全基因组测序 B:具有一定长度的多聚核苷酸链的测序 C:单位点或单基因突变的遗传病检测 D:RNA测序 答案:C 2.如何提高实验的可信性？ A:合理设置对照，平行多次实验 B:反复重复实验直至所有的结果都一致 C:只要实验设计没有问题，实验结果就是可信的 D:在保证实验操作无误的情况下一次性做完实验 答案:A 3.以下关于实验室安全的表述，不正确的是哪一项？ A:使用和储存易燃物时要远离火源 B:为避免扩散，窒息气体和有毒气体的操作应在独立的密闭房间内进行 C:实验前应对所用试剂的分类及特性清楚了解，以便采取适宜的防护手段 D:氧化剂在使用时需要远离易燃物 答案:B 4.如果进行非传染性的病原微生物的相关实验操作，应该在哪个级别的生物安 全实验室中进行？ A:四级 B:二级 C:三级 D:一级 答案:B 5.针对呼吸道侵入这一种危险物入侵人体的方式，最适宜的防护手段是 A:佩戴护目镜 B:戴手套 C:戴口罩 D:在通风橱或通风罩内进行实验 答案:CD 6.如何保证生物分子在实验过程中活性及空间结构不发生明显变化？ A:尽可能缩短实验时间 B:保持适宜的实验温度和反应条件 C:在适宜的环境（包括温度、溶液环境）中储存生物样本 D:缓慢加样以确保实验操作无误 答案:ABC
7.生物化学与基础分子生物学实验的数据结果处理方式包括哪些？ A:讨论法 B:作图法 C:列表法 D:解析法 答案:BCD 8.以下哪些属于对化学危害实施工程控制的范畴？ A:手套箱 B:通风罩 C:口罩及护目镜 D:通风橱 答案:ABD 9.人类基因组计划的实施主要依赖于高通量测序技术（也可称为第二代测序技 术）的发明。 A:错 B:对 答案:A 10.实验只要设置了空白对照，就可以说明实验结果的可靠了。 A:错 B:对 答案:A 11.数据记录过程是否规范并不会影响结果处理的准确性。 A:对 B:错 答案:B 12.CaCl2不属于有毒腐蚀性的化学危险品，所以取用CaCl2时可以直接用手抓 取。 A:错 B:对 答案:A 第二章测试 1.瓶口分液器主要用于： A:微量液体的吸取 B:多通道液体的平行吸取 C:微量液体的定量取用 D:非微量液体的定量取用 答案:D 2.生物大分子的粗分级分离这一过程的目的是 A:破裂细胞，使细胞内容物流出 B:利用某类物质的总体特性获得总提取物