离子交换层析常见问题
离子交换层析中可能会遇到的一些常见问题及其原因和解决方案列举如下：
1．在盐梯度中蛋白质不能洗脱。可能的原因包括缓冲液的pH不对、盐浓度太低。解决方案是使用更接近蛋白质pI的缓冲液和使用更浓的洗脱缓冲液。
2．蛋白质出现在清洗相中。可能的原因包括结合缓冲液的盐浓度太高、样品的盐浓度太高或pH错误、柱子没平衡好、离子变性剂或其他添加剂、结合到柱子上。降低结合缓冲液的盐浓度、更换样品的缓冲液、重复或延长平衡时间直到电导恒定、清洗柱子，有助于解决这个问题。
3．分辨率比预想的要低。可能的原因包括梯度斜率太抖、流速太高、蛋白质或脂质沉淀到柱子上、样品上样前没有恰当过滤、蛋白形成聚合体、凝胶紧密结合、柱子安装不好、检测仪的流动池或柱中或柱后的混合体积太大。使用更平缓的梯度或增加一个平台、较低的流速下分离、清洗和再生柱子、再生柱子、过滤样品、重复层析，有助于提高分辨率。
4．层析图峰形前拖尾或太圆。可能的原因包括柱子超载、柱子没装好、柱子需要再生。降低样品的上样量，重复试验，运行有色的化合物观察条带检测装柱效果，如有必要重装柱子，清洗再生柱子，是解决这个问题的有效途径。
5．获得的蛋白质量正常但活性低。可能的原因包括靶蛋白在洗脱缓冲液中不稳定，因而失活了，酶与辅酶或对其活性是必需的因子分离，柱子上有微生物生长。变换洗脱条件，收集所有的组分进行测定并重复试验，清
洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶，有助于改善这一问题。
6．洗脱级分中蛋白质的量比预想的少得多。可能的原因包括蛋白质被蛋白酶降解，在样品的准备中蛋白质吸附到过滤器上，柱子上有微生物生长。在缓冲液中加蛋白酶抑制剂，使用其他型号的滤器并在缓冲液中加变性剂，清洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶，有助于改善这一问题。
7．样品不结合。原因包括样品盐浓度太高、优化PH、buffer是否含有带电物质(如去垢剂)、柱效下降，CIP清洗。解决方案可以参考优化PH、降低样品中的盐浓度等。
8．结合洗不下来。可能的原因包括增加洗脱液盐浓度、蛋白稳定性不好，已在柱上变性沉淀、优化PH值。可以尝试增加洗脱液中的盐浓度或者更换更合适的PH值来解决问题。
9．纯度不够。原因包括线性梯度洗脱、优化buffer条件、使用更高分辨率产品、增加分子筛，疏水等多步纯化。可以通过改变梯度洗脱的条件，选择更合适的buffer，使用更高分辨率的产品等方式来提高纯度。
以上是一些离子交换层析中可能会遇到的问题及其原因和解决方案，仅供参考。在实际操作过程中遇到的问题可能还需要具体分析原因并采取相应的措施进行解决。
离子交换层析法 一、原理 离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 二、方法与步骤： 1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂...... 2.实验步骤 （1）装柱： 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积; （2）柱的平衡与上样： 用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;
（3）洗杂蛋白： 用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; 分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； （4）解离目的蛋白（洗脱）： 分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; （5）柱的清洗与保存： 用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。 三、适用范围与应用 离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生
离子交换层析法 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 ⒈离子交换剂预处理和装柱：对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 ⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。 洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算： C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。 洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。 ⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
离子交换柱交换层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。 树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。 本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。 二、实验器材 实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、 0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用 0.02mol/L的HCl配制） 三、实验操作记录 1、树脂的处理
干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。 2、装柱前的准备 选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。 将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。 3、装柱 向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。 待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续，均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。 4、平衡 层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。5、加样
离子交换层析在各方面的应用 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。 1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化 代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。通过结合AKTA purifier 记录的层析图谱，含PONl活性成分的SDS-PAGE凝胶电泳分析层析结果及PONl 酶活性监测，综合分析得到优化的PH值。结果显示：AKTA purifier记录的层析图谱显示，以DEAE Sepharose Fast Flow为介质的阴离子交换层析，在分离含有PONl的Cibacron Blue流分中，较高的PH值有利于蛋白质的分离。随PH值增加，PONl与杂质蛋白质逐渐分离，PONl浓度相对蓄积，PH值为9．0及9．5条件下没有额外杂质蛋白质由PONl活性峰分离。PH值为9．O和9．5条件下得到高纯度的PONl，达到经典方案中的纯化效果。 2、超滤／DEAE离子交换层析法分离纯化IgY IgY是一种7S免疫球蛋白，分子量l 80 kDa，由两条重链(分子最67~70 kDa)和两条轻链(分子量22~ 30 kDa)组成，等电点接近5．2。已经证明特异性IgY对人及动物的许多疾病具有一定的预防和治疗作用，与其他用于被动治疗的免疫球蛋白相比，IgY具有价廉易得、稳定性好、可口服等优点，在疾病的免疫检测和防治方面具有良好的应用前景。方希修、王冬梅报道，应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化。首先，卵黄液经过缓冲液稀释分离；然后，用平板式膜组件对其超滤，并且分析了各种因素对其的影响，确定分子截留量为l00kDa，操作压力差为0．12MPa、进料温度为30o C。pH5.2，截留液抗体回收率达到91.89％，纯度为86％：最后，经DEAE高子交换层析得到高纯度的IgY。
离子交换层析说明书 CM Bestarose Fast Flow DEAE Bestarose Fast Flow Q Bestarose Fast Flow SP Bestarose Fast Flow CM, DEAE, Q and SP Bestarose 快速离子交换剂属于分离介质的一部分,主要为色谱工作服务，所有的介质都经过严格的控制生产从而保证其能够满足工业生产的需求。 为了正确操作以便得到最好的分离效果，请在使用前阅读该手册。
目录 1. Bestarose 快速离子交换剂的特性 3 2. 装柱指南12 3. 装柱评价14 4. 保养17 5. 疑难解答17-19
1.Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性 Bestarose Fast Flow离子交换剂是以高度交联的琼脂糖为基质，它的化学、物理性质稳定，即离子载量、洗脱情况、反压及流量等特性不受层析和清洗过程中溶液的影响，详见下表。高物理稳定性使它能在低背压下提供快速液流，在柱高15cm，1 bar压力下，它的流速可达300-700cm/h，见图1。另外，刚性介质体积基本不因pH和离子强度的变化而变化。 线性 流速 图1. Bestarose 快速离子交换剂典型的压力/流速曲线。
CM Bestarose Fast Flow离子交换剂的特性 CM Bestarose Fast Flow是一种弱阳离子交换剂，离子交换基团是羧甲基，如下：-O-CH2COO- 表一. CM Bestarose Fast Flow 特性。 项目指标 离子交换剂类型弱阳离子 总离子载量0.09-0.13mmol/ml 排阻限4×106（球形蛋白） 骨架6%交联琼脂糖 颗粒类型球形，45-165μm 流速300–600 cm/h* 工作温度4–40°C 工作pH 见图2 pH稳定性2-14(短期，CIP) 4-13（长期） 化学稳定性适合所有的缓冲体系 1M NaOH 8M Urea 6M GuHCl 70%乙醇 避免事项氧化剂 长期暴露（1星期，20°C） pH<4 *15cm柱高，1 bar压强，25℃，XK 50/30 柱。
离子交换层析操作时的注意事项 离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。 (1)层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。 (2)平衡缓冲液 离子交换层析的基本反应过程就是离子交换填料平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH 的选择对于分离效果有很大的影响。平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换填料有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换填料的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换填料有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换填料结合或结合不稳定。在一些情况下(如污水处理)可以使杂质与离子交换填料有牢固的结合，而样品与离子交换填料结合不稳定，也可以达到分离的目的。 另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换填料结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。 (3)上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH 值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。 (4)洗脱缓冲液 在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换填料结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH 的洗脱，对于阳离子交换填料一般是pH 从低到高洗脱，阴离子交换填料一般是pH 从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了，可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。 洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换填料上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。(5)洗脱速度 洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。 (6)样品的浓缩、脱盐 离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。
离子交换层析（色谱） 一、原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示： I — 流动相的离子强度，A 和B 为常数， 为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。 离子交换基： 阴离子：DEAE （二乙胺乙基）； QAE （季胺乙基） 阳离子：CM （羧甲基）；SP （磺丙基） 对于蛋白质等两性电解质，在物理意义上，B 为溶质的静电荷数与离子价数之比。在pH 偏离等电点的溶液中，蛋白质溶质的静电数常为两位数以上，故B 值较大，即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感。在同一离子强度下，不同蛋白质的分配系数相差非常大（几个数量级）。 洗脱方式： 恒定洗脱法：洗脱液（流动相）的离子强度不变； 缺点：对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法： 除GFC 以外的层析操作均采用此种方法。 在洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大或阶段梯度增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于脱附的溶质得到洗脱。 线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下： （1）线性梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。 （2）阶段梯度洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱，不需要特殊梯度设备，操作简单； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数（如盐浓度体积）的设计较困难。 离子交换(IEC)的应用及特点 GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段 IEC 分离的特点： （1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲合吸附剂。 疏水作用层析（色谱） 一、原理 疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 二、疏水性吸附剂：将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基：苯基、短链烷基（C 3~C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点： 疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修∞+=m I A I m B )(∞m
离子交换层析操作方法 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、核酸等。其原理是利用固定在固相上的离子交换剂与样品中的离子之间发生物理吸附和解离平衡，通过调节其溶剂系统、pH值、盐浓度等条件，使样品中的不同离子以不同的速率从固相上解离下来，从而实现分离目标分子的目的。 离子交换层析操作可以分为以下几个步骤： 1. 样品处理：样品的处理对于离子交换层析的成功与否至关重要。通常情况下，样品需要经过蛋白质提取等步骤，获得纯净的样品溶液。如果样品中含有较高浓度的盐类等杂质，可以通过浓缩、洗涤等方法去除。 2. 选择合适的离子交换剂：离子交换剂的选择是根据样品中所含离子的性质来决定的。对于阴离子，通常选择带有正电荷的阳离子交换剂（如硫酸树脂、乙二胺树脂等）；对于阳离子，通常选择带有负电荷的阴离子交换剂（如盐酸树脂、硝酸树脂等）。 3. 准备离子交换柱：选择合适的柱子尺寸和填充物，通常为高分子量亲水性凝胶。将填充物装入离子交换柱中，并保持均匀填充。 4. 培养条件：根据样品特性和目的，设置适当的培养条件。其中包括pH值、
溶剂系统和盐浓度。这些条件的选择需要根据样品的性质（酸碱性，亲水性等）和需要分离的目标纯化物的性质来确定。 5. 样品加载：将经过处理的样品加入离子交换柱，采用适当的流速保持平衡。溶剂的选择和流速的控制主要是为了交换离子的速率与静电吸附的速率之间达到适当的平衡。 6. 洗脱：通过改变培养条件或溶剂梯度洗脱目标分离物和杂质。通常使用梯度洗脱的方式，即梯度调整溶剂中的离子浓度，以促进目标物质逐步从离子交换剂上脱附。 7. 浓缩和储存：将洗脱得到的目标分离物浓缩并储存。 离子交换层析操作常见的问题及解决方案： 1. 样品中存在杂质：可以通过前处理步骤（如超滤、浓缩等）进行预处理，去除杂质，以保证在交换剂上发生特异性吸附。 2. 分离效果不佳：可以通过改变溶剂系统、pH值或盐浓度等因素来优化分离条件，选取合适的条件以提高分离效果。 3. 结果重复性差：需要确保操作步骤的一致性，例如样品洗脱时的流速、稳定
离子色谱法离子交换色谱法离子对色谱法的区别 离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换填料的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换填料，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换填料可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。 我们用R 代表离子交换填料的高分子聚合物基质，X-和X+分别代表阳离子交换填料和阴离子交换填料中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+和Y-分别代表阳离子交换填料和阴离子交换填料的平衡离子，A+和A-分别代表溶液中的离子基团。从上面的反应式中可以看出，如果A 离子与离子交换填料的结合力强于Y 离子，或者提高A 离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A 离子将Y 离子从离子交换填料上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。 各种离子与离子交换填料上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换填料的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换填料结合力的差异，并通过改变离子强度、pH 等条件改变各种离子与离子交换填料的结合力而达到分离的目的。离子交换填料的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换填料对离子的结合力顺序为: 。蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换填料的结合与它们的性质及pH 有较大关系。以用阳离子交换填料分离蛋白质为例，在一定的pH 条件下，等电点pI < pH 的蛋白带负电，不能与阳离子交换填料结合；等电点pI > pH 的蛋白带正电，能与阳离子交换填料结合，一般pI 越大的蛋白与离子交换填料结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换填料的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索 离子对色谱法是将一种(或多种)与溶质分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：X+水相+Y-水相===X+Y-有机相 式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。 当达平衡时： KXY=[X+Y-]有机相/[X+]水相[Y-]水相 根据定义，分配系数为： DX=[X+Y-]有机相/[X+]水相=KXY[Y-]水相 [讨论：DX与保留值的关系] 离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离
离子交换层析常见问题 离子交换层析中可能会遇到的一些常见问题及其原因和解决方案列举如下： 1．在盐梯度中蛋白质不能洗脱。可能的原因包括缓冲液的pH不对、盐浓度太低。解决方案是使用更接近蛋白质pI的缓冲液和使用更浓的洗脱缓冲液。 2．蛋白质出现在清洗相中。可能的原因包括结合缓冲液的盐浓度太高、样品的盐浓度太高或pH错误、柱子没平衡好、离子变性剂或其他添加剂、结合到柱子上。降低结合缓冲液的盐浓度、更换样品的缓冲液、重复或延长平衡时间直到电导恒定、清洗柱子，有助于解决这个问题。 3．分辨率比预想的要低。可能的原因包括梯度斜率太抖、流速太高、蛋白质或脂质沉淀到柱子上、样品上样前没有恰当过滤、蛋白形成聚合体、凝胶紧密结合、柱子安装不好、检测仪的流动池或柱中或柱后的混合体积太大。使用更平缓的梯度或增加一个平台、较低的流速下分离、清洗和再生柱子、再生柱子、过滤样品、重复层析，有助于提高分辨率。 4．层析图峰形前拖尾或太圆。可能的原因包括柱子超载、柱子没装好、柱子需要再生。降低样品的上样量，重复试验，运行有色的化合物观察条带检测装柱效果，如有必要重装柱子，清洗再生柱子，是解决这个问题的有效途径。 5．获得的蛋白质量正常但活性低。可能的原因包括靶蛋白在洗脱缓冲液中不稳定，因而失活了，酶与辅酶或对其活性是必需的因子分离，柱子上有微生物生长。变换洗脱条件，收集所有的组分进行测定并重复试验，清
洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶，有助于改善这一问题。 6．洗脱级分中蛋白质的量比预想的少得多。可能的原因包括蛋白质被蛋白酶降解，在样品的准备中蛋白质吸附到过滤器上，柱子上有微生物生长。在缓冲液中加蛋白酶抑制剂，使用其他型号的滤器并在缓冲液中加变性剂，清洗柱子并且在20%乙醇中或其他抑菌剂中保存凝胶，有助于改善这一问题。 7．样品不结合。原因包括样品盐浓度太高、优化PH、buffer是否含有带电物质(如去垢剂)、柱效下降，CIP清洗。解决方案可以参考优化PH、降低样品中的盐浓度等。 8．结合洗不下来。可能的原因包括增加洗脱液盐浓度、蛋白稳定性不好，已在柱上变性沉淀、优化PH值。可以尝试增加洗脱液中的盐浓度或者更换更合适的PH值来解决问题。 9．纯度不够。原因包括线性梯度洗脱、优化buffer条件、使用更高分辨率产品、增加分子筛，疏水等多步纯化。可以通过改变梯度洗脱的条件，选择更合适的buffer，使用更高分辨率的产品等方式来提高纯度。 以上是一些离子交换层析中可能会遇到的问题及其原因和解决方案，仅供参考。在实际操作过程中遇到的问题可能还需要具体分析原因并采取相应的措施进行解决。
简述离子交换层析原理 离子交换层析是一种常用的分离和纯化技术，基于离子交换剂与待分离物质之间的相互作用来实现分离的原理。它是通过将混合物溶液通过含有离子交换树脂的柱子或床层，利用离子交换剂与待分离物质之间的亲和力差异，实现目标物质的吸附和洗脱分离的过程。 离子交换层析的原理可以从以下几个角度来解释： 1. 离子交换剂，离子交换层析中的关键是离子交换剂，它通常是一种高分子化合物，具有含有固定电荷的功能基团，如阴离子交换树脂上的正电荷基团或阳离子交换树脂上的负电荷基团。这些功能基团能够与待分离物质中的离子发生相互作用。 2. 吸附与洗脱，当混合物溶液通过离子交换树脂时，离子交换剂上的功能基团与待分离物质中的离子发生吸附作用。这些离子与离子交换剂之间形成化学键或静电作用力，使其被固定在树脂上。通过改变溶液的条件，如改变pH值或离子浓度，可以改变离子交换剂与待分离物质之间的相互作用，从而实现洗脱目标物质的目的。
3. 选择性分离，离子交换层析的选择性分离依赖于离子交换剂的功能基团和待分离物质之间的亲和力差异。不同的离子交换剂具有不同的功能基团，可以选择性地吸附目标物质。例如，阴离子交换剂可以选择性地吸附带正电荷的离子，而阳离子交换剂可以选择性地吸附带负电荷的离子。通过调整溶液的条件，可以控制目标物质的吸附和洗脱，实现分离纯化。 4. 应用范围，离子交换层析广泛应用于生物化学、制药、环境保护等领域。它可以用于分离和纯化蛋白质、核酸、药物、金属离子等物质。离子交换层析不仅可以实现单一组分的分离，还可以实现复杂混合物的分离。 总结起来，离子交换层析通过离子交换剂与待分离物质之间的相互作用，利用吸附和洗脱的原理实现分离纯化。它具有选择性分离、广泛应用的特点，对于分离和纯化各种物质具有重要的意义。
蛋白质纯化常见问题及解决方案 蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。 常见问题一：蛋白质表达量太低 在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。这可能有以下几个原因： 1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。 2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。 3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。
解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。 常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集 蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集 或失活。这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。 解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些 措施： 1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解 和聚集速度。 2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的 优化。有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。 3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如 L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。 常见问题三：蛋白质纯化的污染
离子交换层析的原理和应用 1. 原理概述 离子交换层析是一种常用的分离和纯化技术，基于离子交换剂与目标物质之间 的相互作用。其原理是利用交换剂固定在固定相上的活性基团与待分离物质之间的化学吸附和解析度差异来实现目标物质的纯化和富集。 2. 交换剂的选择 在离子交换层析中，选择合适的交换剂对分离效果至关重要。 - 强酸型离子交 换剂：适用于分离酸性物质。 - 强碱型离子交换剂：适用于分离碱性物质。 - 强酸 型离子交换剂与强碱型离子交换剂的混合：适用于分离中性物质。 3. 实验步骤 离子交换层析的实验步骤如下： 1. 样品预处理：将待分离物质从样品中提取出 来并纯化。 2. 选择合适的离子交换剂：根据目标物质的特性选择合适的离子交换剂。 3. 准备固定相：将离子交换剂固定在合适的固定相上。 4. 填充层析柱：将固 定相装填到层析柱中。 5. 样品加载：将样品溶液加载到层析柱上，目标物质与离 子交换剂发生相互作用。 6. 洗脱：通过改变溶液条件，如浓度、pH值等，使目标 物质与离子交换剂解离，从而洗脱出来。 4. 应用领域 离子交换层析广泛应用于以下领域： - 生物制药：用于分离和纯化蛋白质、抗体、核酸等生物大分子。 - 环境监测：用于分离和富集水样中的有机和无机污染物。- 食品工业：用于食品添加剂、色素、香料等的分离和纯化。 - 化学分析：用于分 析样品中的离子和有机物质。 - 生命科学研究：用于研究生物大分子的性质和相互 作用。 5. 优点和局限性 离子交换层析具有以下优点： - 分离效果好：可以实现高纯度的目标物质。 - 操作简单：实验步骤相对简单，易于操作。 - 高选择性：可以通过调整离子交换剂 和溶液条件来实现目标物质的选择性分离。 然而，离子交换层析也存在一些局限性： - 样品负荷量有限：由于固定相的固 定容量限制，样品负荷量较小。 - 洗脱效果难以调控：洗脱条件的调控比较复杂， 对操作者要求较高。 - 耗时较长：由于样品加载和洗脱等步骤的需要，离子交换层 析需要较长的时间。
离子交换剂的选择、处理和保存 1. 离子交换剂的选择 离子交换剂的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合 适的离子交换剂。 首先是对离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。强酸或强碱型离子交换剂适用的pH范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。 其次是对离子交换剂基质的选择。前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。 另外离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（ m）来表示，目数越大表示直径越小。前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速 慢；颗粒大则相反。所以大颗粒的离子交换剂适合于对分辨率要求不高的大 １
薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析。 薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需15-30min，分辨力比纸层析高10-100倍，它既能分离0.01μg的微量样品，又能分离500mg 基至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。 一、支持剂的选择与处理 薄层层析的支持剂种类很多。使用时应根据欲分离物质的种类进行选择。 支持剂颗粒大小要适当。颗粒大，展开速度快。但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象。一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm)，薄层厚度为1-2mm；无机类支持剂如氧化铝、硅胶等的颗粒一般为150-300目，薄层厚度为0.25-1mm。 在薄层层析中，使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析。同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理。 二、薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色
蛋白纯化实验常见问题精华解析 本文主要介绍了蛋白纯化过程中常见的问题.内容选择方面恐存众 不足，望指正。 1）我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST 亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GST做亲和层析，但效率只有50～60％左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀，我用0.5％CHAPS 助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。 既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值，看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也是个办法。 2)请问楼主有没有合成过配体为FMN的亲和胶？ 我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，
羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好，此外也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适合的活化介质。不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求，所以要对自己的配基了解比较清楚就可以选择合适的活化介质。我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶，它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以，而且合成的介质刚性好，非特异吸附少，所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定，配基脱落少。我觉得是不错的选择。 包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说.我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件. 层析复性很时髦,但是真正能用的不很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。 3)Sephadex G-25（medium）柱脱盐时，盐浓度太高对柱效有影响吗？若有，一般对盐浓度限度如何？ 大家别客气，除盐对于浓度应该也是有一定的限制的，同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些，相对需要的柱子的分辨率也要高点，但是在正常的范围如1-2M应该影响不大，不过要除得很干净还是尽量少上点样品，我觉得上样的体积毕竟比浓度