蛋白质离子交换层析技术
【Major】2009-04-02 14:47:45 阅读19 评论0 字号：大中小订阅
摘要：本文介绍了离子交换的基本理论、影响分离纯化的因素、常见的离子交换剂和树脂的处理，以及离子交换层析的基本操作方法。列举了离子交换层析技术的一些最新应用。
关键词：离子交换层析基本理论树脂处理操作方法应用进展
Protein Ion Exchange Chromatography Technique
Abstract:The basic theories of ion exchange, factors that can influence the separation and purification of proteins, common ion exchangers, ways of processing the resin and basic operating method of ion exchange chromatography are introduced. Some latest applications of this technique are enumerated.
Keywords: Ion exchange chromatography; basic theories; resin processing; operating method; advancement of application
近年来，随着基因工程和细胞融合技术的发展，利用细菌发酵和动植物细胞培养表达蛋白质成为一种常规技术。和其它生物产品的生产过程一样,蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物,下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。为了生产高纯度、高活性的生物制品，生物工程技术研究经费的30％需花费在分离纯化工艺过程的研究上，调查结果显示，利用传统的分离纯化技术纯化分离阶段的平均生产费用占总生产成本的80％。
在众多的蛋白质分离纯化技术中,层析是一门关键技术, 它通常在分离工序的后部,决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比,层析技术具有分离效率高、适用性广和过程易于放大、易于自动化的特点,因而得到了广泛的应用[1]。
本文将对其中的离子交换层析技术作详细介绍。
1 基本理论
1.1 离子交换的概念
离子交换是利用各带电粒子与离子交换剂之间结合理的差异进行物质分离的操作方法。
1.2 离子交换的原理
氨基酸、蛋白质、核酸等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷。由于生物分子自身的性质差异，造成了在特定的介质中所带的电荷种类和密度不同，这就是离子交换的理论依据。
离子交换现象可用下面的方程式表示：
阳离子交换反应：
Resin-SO3H + Na+= Resin-SO3 Na + H+
Resin-SO3Na + H+= Resin-SO3 H + Na +
阴离子交换反应：
Resin-N(CH3) 3OH + Cl-= N(CH3) 3 Cl + OH-
图1 离子交换过程的机理
A+自溶液中扩散到树脂表面
A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心
A+与RB在活性中心上发生复分解反应
解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面
B+离子从树脂表面扩散到溶液中
交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制
Resin-N(CH3) 3 Cl + OH-= N(CH3) 3 OH + Cl -
1.3 离子交换的分类
1.3.1 分类
按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴。
（1）强酸性阳离子交换剂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H （次甲基磺酸基）；
（2）弱酸性阳离子交换剂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH 等弱酸性基团；
（3）强碱性阴离子交换剂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-ß-羟基乙基胺基；
（4）弱碱性阴离子交换剂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽，而弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小。
1.3.2常见离子交换树脂的鉴定
在树枝的使用过程中，由于保管不善或其他的偶然因素，即将树脂搞混。而各类树脂的形状和颜色又无统一的规定，故单从外观很难识别阴阳。
彦文斌等建立了简便的方法，利用CuSO4、HCl、NaOH、NH3.H2O、酚酞和甲基红等试剂鉴定四类常见树脂[2]。（见图2）
图2 常见离子交换树脂的鉴定
1.4 常用的离子交换剂
1.4.1 离子交换树脂
离子交换树脂是一种在交联聚合物结构中含有离子交换基团的功能高分子材料。离子交换树脂不溶于酸、碱溶液及各种有机溶剂,结构上属于既不溶解、也不熔融的多孔性固体高分子物质。每个树脂颗粒都由交联的具有三维空间立体结构的网络骨架构成,在骨架上连接着许多较为活泼的功能基。这种功能基能离解出离子,可以与周围外边离子相互交换。离子交换树脂的单元结构由三部分组成:不溶性的三维空间网状骨架、连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反电荷的可交换离子[3]。
1.4.2 离子交换纤维素
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。
特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高
常用的离子交换纤维素有：甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素（CMC）、二乙基氨基乙基纤维素（DEAE）
1.4.3 离子交换葡聚糖
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物，如sepharose、sephadex。
特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率。
目前,商品化的离子交换层析介质品种很多[4]。
1.5 影响交换速度的因素
离子交换速度的影响因素很多，综合起来主要有以下几个方面：
（1）颗粒大小：愈小越快
（2）交联度：交联度小，交换速度快
（3）温度：越高越快
（4）离子化合价：化合价与高，交换越快
（5）离子大小：越小越快
（6）搅拌速度：在一定程度上，越大越快
（7）溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快
1.6 影响离子交换选择性的因素
（1）水合离子半径：半径越小，亲和力越大；
（2）离子化合价：高价离子易于被吸附；
（3）溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；
（4）离子强度：越低越好；
（5）有机溶剂：不利于吸附；
（6）交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；
（7）树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；
2离子交换剂的处理、再生和转型
2.1 处理
由于新树脂在生产和运输途中会引入一些中间体和一些杂质,所以应用前要处理。首先要去杂、过筛，粒度过大时可稍加粉碎，对于粉碎后或粒度不均匀的树脂应进行筛选和浮选处理，以保证树脂粒度均匀。用蒸馏水、乙醇浸泡（去除残存的少量有机杂质）后,再用约1mol/L的NaOH 和1mol/L的HCl反复冲洗。可用十倍树脂量的液体,各3次,每次酸和碱处理转换时用水洗至中性,最后用水洗至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱[5]。
2.2 再生
树脂可以重复使用,使用其吸附有效成分后,将有效成分洗脱下来,可以再利用,需要用酸碱转型,用水洗至中性,但是用的次数多了,会有一些杂
质在上面影响效率,需要彻底再生或换新树脂,一般树脂可以使用20次以上。再生方法:用氢氧化钠处理、浸泡(阴树脂),或用盐酸处理、浸泡(阳树脂),也可以用饱和盐水浸泡。动态再生方法比一般再生方法优越。被铁离子污染的阴离子交换树脂用亚硫酸钠去除较彻底。[5]
近年，清华大学报道了利用水代替酸碱作为再生剂再生失效离子交换树脂的体外电再生工艺,使离子交换水处理变为一种绿色环保水处理技术[6]。
2.3 转型
转型是为了发挥树脂的交换性能，按照使用要求人为地赋予平衡离子的过程。对于弱酸或弱碱型树脂须用碱（NaOH）或酸（HCl）转型，对于强酸或强碱型树脂除使用酸碱外还可以用相应的盐溶液转型。
总之，对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，即要求其带上使用时所期望的离子或基团。
3 离子交换层析基本操作方法
3.1 树脂的选择
选择离子交换树脂的主要依据是被分离物质的性质和分离目的。最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离，碱
性物质用阳离子交换剂分离，氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择。
当目的具有较强的碱性或酸性时，宜选用弱酸或弱碱性的树脂，这样有助于提高选择性并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质，往往选用强碱或强酸树脂。对于大多数蛋白质、酶和其他生物大分子的分离多采用弱酸或弱碱性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。
3.2 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：10～1：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。
3.3 装柱
先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶2～3cm为宜。
3.4 平衡缓冲液
平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。
3.5 上样
离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5%(体积分数)为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样母刚好全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质。
3.6 洗脱缓冲液
在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH 值从高到低。由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。
3.7 洗脱速度
洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。
3.8 样品的浓缩、脱盐
离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。
另外在层析分离过程中还要注意操作手段和溶液环境，如温度、压力和缓冲系统对欲分离物质稳定性的影响，避免被分离物质失活[7]。
4应用进展
离子交换树脂不溶于一般的酸、碱溶液及许多有机溶剂。它以交换、选择、吸收和催化等功能来实现除盐、分离、精制、脱色和催化等应用效果。它广泛应用于电力、化工、冶金、医药、食品和原子能等部门,主要是制取软水和纯水三废处理及分离精制药品等[8]。
许多研究者不断尝试将该技术应用于多种物质的分离纯化。如府静燕等[9]研究了丝胶蛋白质对阴离子交换纤维的吸附性能以及从阴离子交换纤维上解析丝胶蛋白质的最佳条件。喇文军等[10]离子交换层析法对玉米蛋白酶解液进行了分离纯化，得到降血压肽并研究了离子强度、离子强度梯度以及上样量对分离效果的影响,得到最佳分离条件。
新型离子交换剂也是研究开发的重点，如施扬等[11]以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，三聚异氰尿酸三烯丙酯和二乙烯基苯为交联剂，甲苯和正庚烷为有机致孔剂，用原位聚合的方法合成亲水性高分子载体。胺化反应后，得到含二乙胺基羟丙基的阴离子交换剂新型双孔蛋白质离子交换剂的制备及性能研究。在此基础上，采用固体颗粒与有机溶剂联合致孔模式，以硫酸钠颗粒为固体致孔剂，制备新型双孔离子交换剂并比较了两种树脂的孔结构及其对牛血清白蛋白的吸附行为。
此外，离子交换层析与其他技术的联合应用也在发展之中。马晓轩等[12]研究了利用批量离子交换层析与凝胶过滤层析相结合的方法纯化类人胶原蛋白I的最佳条件并分别考察了不同离子交换树脂、缓冲溶液pH、离子强度、进料蛋白浓度对批量离子交换的影响，以及不同凝胶过滤介质对凝胶过滤层析的影响。赵荣乐等[13]以离子交换层析和凝胶过滤成功地从盐源山蛭头部分离纯化了抗凝血多肽。
参考文献
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蛋白纯化离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，羧基电离，蛋白质带负电荷，蛋白质能够被阴离子交换剂所吸附，相反，当溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷，被阳离子交换剂所吸附，溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质带电荷越多，与交换剂的结合程度也越强，反之则越弱。 当溶液的pH值发生改变时，蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变化，因此可以通过改变洗脱液的pH值来改变蛋白对交换剂的吸附能力，从而把不同的蛋白质逐个分离，当pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱，当pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 另外，无机盐离子（如NaCl）对交换剂也具有交换吸附的能力，当洗脱液中的离子强度增加时，无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 因此，洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时，则降低pH值，增加盐离子浓度；洗脱阳离子交换剂结合蛋白时，则升高溶液pH值，增加盐离子浓度，能够洗脱交换剂上的结合蛋白。
离子交换层析法 一、原理 离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 二、方法与步骤： 1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂...... 2.实验步骤 （1）装柱： 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积; （2）柱的平衡与上样： 用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;
（3）洗杂蛋白： 用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; 分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； （4）解离目的蛋白（洗脱）： 分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测; （5）柱的清洗与保存： 用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。 三、适用范围与应用 离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生
离子交换层析 离子交换层析是常见的层析方式之一，它以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行,广泛应用于氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等的分析、制备、纯化以及溶液的脱色、中和等方面。离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH 条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH 值洗脱下来。 基本原理 离子交换剂的组成 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团) 和反离子构成的。 离子交换层析（固定相）的特性 在水中呈不溶解状态，但能释放反离子，同时与溶液中其他离子或离子化合物可逆性结合，并且结合后本身的理化性质不变 如：RA + B+ RB + A+ 或RA + B- RB + A- 离子交换层析的原理 由于离子交换剂的选择性，对不同的离子或离子化合物有不同的结合力，所以用洗脱剂洗脱时，结合力小的先被洗脱出来，结合力大的后被洗脱下来，从而达到分离混合物的目的(离子交换剂的选择性决定其与溶液中离子的结合力大小，通常用离子交换剂与溶液中离子的反应平衡常数表示) [RB][A + ] = [RB][B +] 当[A+]=[B+]时 若 K B A ＞1，即[RB]＞[RA],表示离子交换剂对B+的结合力比A+ 大 若 K B A = 1，即[RB]=[RA],表示离子交换剂对B+的结合力与A+ 相等 若 K B A ＜1，即[RB]＜[RA],表示离子交换剂对B+的结合力比A+ 小 K B A 值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性的参数 规 律 ①强酸性阳离子交换剂对H+的结合力比对Na+小 ②强碱性阴离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-小得多 ③弱酸性离子交换剂对H+的结合力比对Na+大 ④弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-大 B A K ] [][RA RB K B A
DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白 发布时间：2009-09-26 来源：生物网文章标签：柱层析免疫球蛋白生物论坛 离子交换柱层析法分离核苷酸 离子交换柱层析分离核苷酸 不同分子量蛋白质的分离——凝胶柱层析 (一) 原理 DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为 PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。 (二)试剂和器材 1、试剂: (1)盐析提取的人γ球蛋白； (2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3； (3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)； (4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)； 2、器材: (1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)； (2)普通冰箱，751 抗体纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白发布时间：2010-04-05 来源：生物网文章标签：柱层析免疫球蛋白生物论坛
离子交换柱层析法分离核苷酸 DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋 抗体纯化：DEAE-Sephadex A-50柱层析纯 (一) 原理 DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH将CL-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为 PH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。在PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析γ球蛋白便可在洗脱中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱层析是离子交换层析的一种。 (二)试剂和器材 1、试剂: (1)盐析提取的人γ球蛋白； (2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3； (3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)； (4)0.1M, PH7.4 PB(配制见盐析部分)； 2、器材: (1)层析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)； (2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度计，电导仪、抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计； (3)透析袋、座标纸、滤纸、PH精密试纸； (4)量筒、烧杯、试管、吸管、滴管、灭菌小瓶等。 (三) 操作步骤 1、DEAE-Sephadex A-50预处理 称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5克，悬于500ml蒸馏水，1小时后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl 同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中过夜。 2、装柱 (1)将层析柱垂直固定于滴定铁架上，柱底垫一园尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 (2)将0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2-3cm厚时，启开出水口螺旋夹，控制流速1ml/分钟，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
离子交换层析纯化蛋白质的原理 离子交换层析是一种重要的蛋白质分离纯化技术。其原理是利用离子交换树脂库中树 脂的静电荷性吸附靶分子，通过调节合适的洗脱条件使目标蛋白质逐步从树脂上溶解剂洗脱，最终获得高纯度的目标蛋白质。 离子交换层析基于了离子之间相互作用的原理。树脂表面带有离子团，使得树脂能够 吸附离子性化合物。离子性化合物在电解质溶液中通常呈现出离子化的形式，离子化能力 与化合物本身的酸碱性及离子外壳多少有关。不同的离子性化合物在电解质水溶液中，因 其不同的离子半径和电荷量而表现出不同的离子吸附效应，因此可通过调节离子交换树脂 的固有电荷性质，控制所吸附蛋白质的亲和力。 一般来说，离子交换树脂会分为两种：阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交 换树脂通常带有负电荷，用于吸附正电荷的蛋白质，如赖氨酸、精氨酸等。阴离子交换树 脂带有正电荷，用于吸附负电荷的蛋白质，如天冬酰胺酸、谷氨酸等。蛋白质在交换树脂 上的吸附与蛋白质表面的极性、电荷以及交换树脂的化学性质有关。 在离子交换层析中，吸附规律通常分为两种类型：强吸附和弱吸附。强吸附是指交换 树脂与目标蛋白质之间的非常紧密的结合，需要用高盐度、酸性或碱性的溶液才能使其从 树脂上溶解剂洗脱。相反，弱吸附是指交换树脂与目标蛋白质较松散的结合，可通过一些 较弱溶剂去除目标蛋白质。 离子交换层析的优点在于具有高纯度和针对性、操作简便等特点，适用于表达量较高 的蛋白质分离。然而，由于蛋白质的结构多样性和多样化，交换树脂吸附效应的不确定性，以及强洗脱所带来的影响，都可能导致影响纯度和可行性的问题。因此，在离子交换层析前，必须对样品的基本性质进行详细的研究和解析，以确定适当的实验条件，并实现当代 生物技术领域的进一步深化。
分离蛋白质的方法 蛋白质是生命体中最基本的组成部分之一，具有重要的生物学功能。分离蛋白质是生物学研究中的重要步骤，可以用于蛋白质的纯化、结构和功能的研究，以及生物技术的开发。本文将介绍常用的分离蛋白质的方法，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、透析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 1. 离子交换层析 离子交换层析是一种基于电荷的分离方法，利用离子交换树脂对蛋白质的电荷进行分离。在离子交换树脂上，蛋白质与树脂中的离子进行竞争吸附，通过改变溶液pH值、离子浓度等条件，可以控制蛋 白质与树脂的相互作用，实现蛋白质的分离。 离子交换层析具有选择性强、分离效果好、操作简单等优点，但也存在一些缺点，如分离过程需要控制多个条件，操作较为复杂，且易受污染影响。 2. 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种基于分子大小的分离方法，利用孔径大小不同的凝胶进行分离。凝胶过滤层析的原理是，大分子无法进入凝胶内部，只能在凝胶表面被吸附，而小分子可以进入凝胶内部，因此分子量大的蛋白质会被滞留在凝胶上，分子量小的蛋白质则可以通过凝胶，实现分离。 凝胶过滤层析具有分离效果好、操作简单等优点，但也存在一些缺点，如分离效率低、对样品浓度要求高等。
3. 亲和层析 亲和层析是一种基于分子亲和力的分离方法，利用蛋白质与某些特定配体之间的亲和力进行分离。亲和层析的原理是，将配体固定在固相基质上，使其与目标蛋白质发生特异性结合，然后通过改变溶液pH值、离子浓度等条件，实现目标蛋白质的洗脱。 亲和层析具有选择性强、分离效果好、操作简单等优点，但也存在一些缺点，如配体的选择性和稳定性较差、洗脱条件要求严格等。 4. 透析 透析是一种基于分子大小和渗透压的分离方法，利用半透膜对分子的选择性渗透进行分离。透析的原理是，将混合物置于半透膜中，分子量小的物质可以通过半透膜，而分子量大的物质则被滞留在半透膜上。 透析具有操作简单、对样品浓度要求低等优点，但也存在一些缺点，如分离效率低、易受污染影响等。 5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种基于分子大小和电荷的分离方法，利用电场对分子进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理是，将样品置于凝胶中，然后通过电场对凝胶中的分子进行分离，分子量大的分子会被滞留在凝胶上，分子量小的分子则会在凝胶中迁移。 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分离效果好、操作简单等优点，但也存在一些缺点，如分离效率低、对样品浓度要求高等。 综上所述，分离蛋白质的方法有多种，每种方法都有其适用的情
离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析(Ion Exchange Chromatography 简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法,也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法. 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75％的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应.平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离.下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程. 阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上.而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除.通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱.随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结
蛋白质离子交换层析技术 【Major】2009-04-02 14:47:45 阅读19 评论0 字号：大中小订阅 摘要：本文介绍了离子交换的基本理论、影响分离纯化的因素、常见的离子交换剂和树脂的处理，以及离子交换层析的基本操作方法。列举了离子交换层析技术的一些最新应用。 关键词：离子交换层析基本理论树脂处理操作方法应用进展 Protein Ion Exchange Chromatography Technique Abstract:The basic theories of ion exchange, factors that can influence the separation and purification of proteins, common ion exchangers, ways of processing the resin and basic operating method of ion exchange chromatography are introduced. Some latest applications of this technique are enumerated. Keywords: Ion exchange chromatography; basic theories; resin processing; operating method; advancement of application 近年来，随着基因工程和细胞融合技术的发展，利用细菌发酵和动植物细胞培养表达蛋白质成为一种常规技术。和其它生物产品的生产过程一样,蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物,下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。为了生产高纯度、高活性的生物制品，生物工程技术研究经费的30％需花费在分离纯化工艺过程的研究上，调查结果显示，利用传统的分离纯化技术纯化分离阶段的平均生产费用占总生产成本的80％。
蛋白质纯化方法 蛋白质作为生物体内重要的功能分子之一，其纯化方法的选择对于生物学研究和工业生产中的蛋白质制备具有至关重要的意义。纯化蛋白质能够去除与目标蛋白质无关的其他生物分子，从而提高蛋白质的纯度和活性。在本文中，将介绍几种常用的蛋白质纯化方法。 一、溶液层析 溶液层析是一种常用的蛋白质纯化方法。该方法利用分子大小、电荷和亲水性等差异，将混合物中的蛋白质分离开来。常见的溶液层析方法包括凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。 1. 凝胶层析 凝胶层析是一种基于分子大小的分离方法。常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺薄膜和聚糖凝胶等。这些凝胶材料具有不同的孔隙结构，通过选择合适孔径的凝胶材料，可以将目标蛋白质与其他分子分离开来。 2. 离子交换层析 离子交换层析是一种基于分子电荷的分离方法。该方法利用纯化材料表面的离子交换基团与蛋白质间的电荷交互作用，将蛋白质分离开来。阳离子交换材料选择带有阴电荷的材料，而阴离子交换材料选择带有阳电荷的材料。 3. 亲和层析
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。该方法利用纯化材料表面的特定化合物与目标蛋白质之间的特异性相互作用，将目标蛋白质与其他分子分离开来。常见的亲和层析材料有亲和树脂和亲和薄膜等。 二、电泳分离 电泳分离是一种基于蛋白质电荷和大小的分离方法。常见的电泳分离方法包括SDS-PAGE和等电聚焦。 1. SDS-PAGE SDS-PAGE是一种基于蛋白质分子大小的分离方法。该方法利用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质分子包裹成带负电的复合物，使其在凝胶电泳时按照分子大小分离开来。通过引入分子量标记物，可以根据标记物的迁移距离来确定目标蛋白质的分子量。 2. 等电聚焦 等电聚焦是一种基于蛋白质电荷的分离方法。该方法利用胶体颗粒的电动流动使蛋白质在电泳过程中在不同的pH值时停止运动，从而达到分离的目的。等电聚焦在凝胶上形成pH梯度，蛋白质在梯度中由于电荷变化发生位置变化。 三、高效液相色谱 高效液相色谱（HPLC）是一种高效的蛋白质纯化方法。该方法通过利用溶液中蛋白质与色谱填料之间的相互作用，实现目标蛋白质与其他分子的分离。
蛋白质的分离纯化技术 1、根据蛋白质带电性质不同的分离技术 1.1离子交换层析 以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类, 还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。 1.2电泳法 电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异高分辨率地分离或分析蛋白质。在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。 2、根据蛋白质溶解度不同的分离技术 2.1蛋白质的盐析 蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。 2.2有机溶剂沉淀法 有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。常用的有机溶剂有乙醇或丙酮。同时，为了防止蛋白质变性，应在低温下沉淀。2.3等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质具有不同的等电点的特点
离子交换层析（色谱） 一、原理 离子交换层析(Ion exchange chromatography, IEC)是利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式表示： I — 流动相的离子强度，A 和B 为常数， 为离子强度无限大时溶质的分配系数，是静电相互作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。 离子交换基： 阴离子：DEAE （二乙胺乙基）； QAE （季胺乙基） 阳离子：CM （羧甲基）；SP （磺丙基） 对于蛋白质等两性电解质，在物理意义上，B 为溶质的静电荷数与离子价数之比。在pH 偏离等电点的溶液中，蛋白质溶质的静电数常为两位数以上，故B 值较大，即蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感。在同一离子强度下，不同蛋白质的分配系数相差非常大（几个数量级）。 洗脱方式： 恒定洗脱法：洗脱液（流动相）的离子强度不变； 缺点：对于在吸附柱上分配系数相差较大的蛋白质很难实现很好的分离。 线性梯度洗脱法或阶段梯度洗脱法： 除GFC 以外的层析操作均采用此种方法。 在洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大或阶段梯度增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大，使恒定洗脱条件下难于脱附的溶质得到洗脱。 线性梯度洗脱和阶段梯度洗脱法的优缺点如下： （1）线性梯度洗脱法： 优点：流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作范围广； 缺点：需要特殊的调配浓度梯度的设备。 （2）阶段梯度洗脱法： 优点：利用切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗 脱，不需要特殊梯度设备，操作简单； 缺点：因为流动相浓度不连续变化，容易出现干扰峰。 此外，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象，因此洗脱操作参数（如盐浓度体积）的设计较困难。 离子交换(IEC)的应用及特点 GFC — 主要用于产物的初步纯化和中后期脱盐 IEC — 是蛋白质、肽和核酸等生物产物的主要纯化手段 IEC 分离的特点： （1）料液处理量大，具有浓缩作用，可在较高流速下操作； （2）应用范围广泛，优化操作条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长较短； （3）产品回收率高； （4）商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格也远低于亲合吸附剂。 疏水作用层析（色谱） 一、原理 疏水作用层析(Hydrophobic interaction chromatography, HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团的疏水吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。 二、疏水性吸附剂：将下表所列的各种凝胶过滤介质偶联上疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基：苯基、短链烷基（C 3~C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 吸附特点： 疏水性吸附作用的大小与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修∞+=m I A I m B )(∞m
离子交换层析操作方法 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、核酸等。其原理是利用固定在固相上的离子交换剂与样品中的离子之间发生物理吸附和解离平衡，通过调节其溶剂系统、pH值、盐浓度等条件，使样品中的不同离子以不同的速率从固相上解离下来，从而实现分离目标分子的目的。 离子交换层析操作可以分为以下几个步骤： 1. 样品处理：样品的处理对于离子交换层析的成功与否至关重要。通常情况下，样品需要经过蛋白质提取等步骤，获得纯净的样品溶液。如果样品中含有较高浓度的盐类等杂质，可以通过浓缩、洗涤等方法去除。 2. 选择合适的离子交换剂：离子交换剂的选择是根据样品中所含离子的性质来决定的。对于阴离子，通常选择带有正电荷的阳离子交换剂（如硫酸树脂、乙二胺树脂等）；对于阳离子，通常选择带有负电荷的阴离子交换剂（如盐酸树脂、硝酸树脂等）。 3. 准备离子交换柱：选择合适的柱子尺寸和填充物，通常为高分子量亲水性凝胶。将填充物装入离子交换柱中，并保持均匀填充。 4. 培养条件：根据样品特性和目的，设置适当的培养条件。其中包括pH值、
溶剂系统和盐浓度。这些条件的选择需要根据样品的性质（酸碱性，亲水性等）和需要分离的目标纯化物的性质来确定。 5. 样品加载：将经过处理的样品加入离子交换柱，采用适当的流速保持平衡。溶剂的选择和流速的控制主要是为了交换离子的速率与静电吸附的速率之间达到适当的平衡。 6. 洗脱：通过改变培养条件或溶剂梯度洗脱目标分离物和杂质。通常使用梯度洗脱的方式，即梯度调整溶剂中的离子浓度，以促进目标物质逐步从离子交换剂上脱附。 7. 浓缩和储存：将洗脱得到的目标分离物浓缩并储存。 离子交换层析操作常见的问题及解决方案： 1. 样品中存在杂质：可以通过前处理步骤（如超滤、浓缩等）进行预处理，去除杂质，以保证在交换剂上发生特异性吸附。 2. 分离效果不佳：可以通过改变溶剂系统、pH值或盐浓度等因素来优化分离条件，选取合适的条件以提高分离效果。 3. 结果重复性差：需要确保操作步骤的一致性，例如样品洗脱时的流速、稳定
离子交换层析技术的解析 离子交换层析技术是一种基于离子交换原理的分离纯化技术，适用于各种液体和气体中离子的分离、纯化和富集等。其原理是通过一种固定于生化载体上的离子交换树脂，对样品中的离子进行吸附、分离、洗脱等处理，从而获得高纯度、高效率的目标离子。 离子交换层析技术的基本原理和流程 离子交换层析技术的基本原理是利用离子交换树脂对溶液中离子进行选择性吸附的原理进行分离，其主要流程包括样品的预处理、树脂的固定、离子的吸附、洗脱和再生等几个关键步骤。 样品的预处理，通常包括调整样品pH、滤液和去除杂质等。然后将样品加入离子交换树脂中，在一定的纵向或横向流动条件下，离子通过离子交换树脂的静电作用被吸附下来，从而实现了离子的选择性分离。 离子交换层析技术的应用
离子交换层析技术广泛应用于各种检测，分析和生产场合，如 制药、食品、环保、化工、生物等领域。其中，离子交换层析技 术在制药领域中的应用十分重要。离子交换层析技术可用于药物 纯化、多肽纯化、基因表达产物探究、酶学研究、蛋白质研究等。此外，离子交换层析技术还可以用于制药企业原料药检测和生产 工艺的优化。 离子交换层析技术优点 与其他技术相比，离子交换层析技术具有分离效率高、操作简单、可靠性高、灵敏度高等优点，同时也具有一定的分度能力， 因此在生物分子或配体的纯化、鉴定和定量的分离分析方面具有 独特的优越性。 离子交换层析技术的未来发展 虽然离子交换层析技术已经成为生产领域中不可或缺的一种技术，但是离子交换层析技术还面临着很多问题，主要包括低效率、高成本、难以批量生产等问题。未来发展的方向主要包括开发新 型的高效离子交换树脂、不断提高离子交换层析技术的选择性、 发展更加便捷和经济的离子交换层析技术等。
离子交换柱层析分离与纯化凝集素 一、实验目的 本实验以红花石蒜为材料，将其粗提液进行硫酸铵沉淀后，再用离子交换柱层析进行分离。本实验的目的是：了解离子交换层析技术的原理，掌握用离子交换层析技术分离蛋白质的基本技术。 二、实验原理 离子交换层析分离蛋白质的过程,主要是利用蛋白质具有不同的电荷而进行分离。依靠增加缓冲液中的离子强度或改变pH值使蛋白质带不同种类和数目的电荷，改变蛋白质与离子交换剂的结合状况,从而使不同的蛋白质得以分离。要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值），使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。 离子交换剂是连接有离子基团的不溶性惰性颗粒，可由多种材料制成,如纤维素,葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶和合成树脂。常用于蛋白质分离纯化的离子交换剂为离子交换纤维素,离子交换葡聚糖凝胶和离子交换琼脂糖凝胶。带正电荷的离子交换剂可以靠静电结合阴离子，称为阴离子交换剂。带负电荷的离子交换剂称为阳离子交换剂。离子交换剂根据带电基团解离程度的不同,又有强弱之分。强离子交换剂的带电基团在所有pH范围内解离；弱离子交换剂的带电基团的解离状态则取决于pH，只在一定pH范围内解离。 本实验采用的凝胶柱为DEAE-Sephrose阴离子交换琼脂糖凝胶柱。 三、试剂与器材 主要试剂：弱碱型阴离子交换琼脂糖凝胶：DEAE-Sephrose，NaOH，NaCl，Tris，盐酸，乙醇。 主要溶液： 生理盐水、0.5M NaOH溶液、0.05M, pH7.6 Tris-HCl缓冲液、0.05M, pH7.6 含1M NaCl 的Tris-HCl缓冲液 主要器材： 离子交换层析柱、储液瓶、梯度洗脱仪、紫外检测仪和记录仪、部分收集器、pH计、恒流泵、透析袋 四、试剂配制 1．配制1L，0.5M，pH7.6的Tris-HCl母液 （M r=121.14） 称量60.57g Tris，加入400ml蒸馏水将粉末溶解后，加入适量盐酸调pH值至7.6，最后定容至1L
根据分子大小分离蛋白质的层析技术 蛋白质是生命体内重要的组成部分，在生命的各个过程中都发挥着至关重要的作用。分离和纯化蛋白质，是开展蛋白质相关研究的前提和关键。分子大小是影响蛋白质结构和功能的一个重要因素，因此，根据分子大小分离蛋白质的层析技术应用广泛。 胶体电泳是一种通过电场驱动带电粒子（涂层蛋白）在胶状介质中运动的技术。随着电泳时间的推移，蛋白质会在胶体电泳中沿电场方向移动，并在不同位置出现带状。这些带状代表了不同大小、电荷和形态的蛋白质，从而实现了蛋白质的分离和纯化。 凝胶过滤层析技术是基于蛋白质分子大小的一种分离技术。它使用别称为Sephadex的高分子树脂作为填料，将蛋白质溶液通过柱子或柱状材料，使大分子蛋白质无法进入树脂孔隙，而小分子蛋白质则可以进入树脂孔隙内，从而实现了分离。分子量越大的蛋白质会沿着柱子的表面流动，分子量较小的蛋白质会进入树脂颗粒内部，因此可以在凝胶孔隙中分子大小的差异进行分离。 离子交换层析技术是一种通过电荷相互作用分离蛋白质的技术。该技术使用带正电或负电的固定颗粒，不同电荷的蛋白质会与固定颗粒进行相互作用。通常情况下，具有相同荷负性的蛋白质将更紧密地结合于离子交换树脂中，并较难从中被洗脱出来。使用不同盐浓度的溶液，可以通过离子交换层析进一步洗脱蛋白质。 亲和层析是一种利用蛋白质之间的特殊作用力进行分离的技术。它是一种选择性纯化技术，通过特殊的柱子层析填料，将表面特异性结合的蛋白质吸附在固定颗粒的表面。在分离过程中，具有特定亲和性的分子可以与填料表面固定的某些物质特异地结合。与这些物质不结合的分子则在纯化过程中被排除。亲和层析的优点是可以选择性纯化目标蛋白质。 总之，根据分子大小分离蛋白质的层析技术是一种重要的蛋白质分离和纯化技术。通过不同的层析技术，可以针对不同的蛋白质特性实现利用分子大小、电荷和特殊作用力进行分离。这些技术在学术研究、医学诊断和新药开发等领域都有广泛的应用。
离子交换层析技术在血液制品分离纯化 中的应用 摘要离子交换层析技术因其反应条件温和易保持蛋白质天然构象已广泛 应用于血液制品的制备，目前大多采用将低温乙醇蛋白分离法与离子交换层析工 艺相结合制备工艺。本文介绍了离子交换层析技术在血液制品中的应用，并比较 了传统法与离子交换层析法制备方式的区别。层析法自动化程度高、批次质量稳 定性好，更具有规模化生产推广意义。 关键词血液制品；离子交换层析；分离提纯 1背景 血液制品特指血浆蛋白制品和相应的重组制品，是由健康人血浆或经特异免 疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制备的血浆蛋白组分，以及血液细 胞有形成分的统称。血液制品主要分为白蛋白类、免疫球蛋白类、凝血因子类和 微量蛋白制品等不同种类[1]。20世纪40年代，由Cohn采用的低温乙醇法分离纯 化血液制品，是世界血浆蛋白分离规模化生产的基础。但是随着科技的进步以及 社会多元化的需求，仅依靠原有分离技术获得的产品已经很难满足社会需要，因 此血液制品的分离纯化技术亟需变革。由于组成蛋白质的氨基酸种类和数量不同，因此不同的蛋白质有不同的等电点，这就为血液制品的提纯分离提供了新方法， 即离子交换层析法。其原理是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进 行的分离方法。从根本上改变了原有技术分离时间长、步骤繁琐、分离效果差、 产品种类少、自动化程度低等缺点，有效地提高了原料血浆的利用率及使用安全性，丰富了产品的种类[2]。 2离子交换层析技术在血液制品中的应用 2.1人血白蛋白
人血白蛋白(human serum albumin, HSA)是人体血浆蛋白之中含量最多的蛋白质（约占60%左右），是最早从血浆中分离出的一类蛋白，并作为血浆扩容剂广泛应用于临床治疗中。以Cohn法和Kistler法为主的低温乙醇工艺是目前使用最多的HSA制备方法，但分离步骤多、分离周期长、工艺复杂且全程要求低温环境，并且制品纯度不高。早在1993年，Yap等[3]研究发现低温乙醇结合离子交换层析技术从组分II、III上清液提取的HSA纯度可达99.5%，远高于单纯采用低温乙醇法制备的90%。我国大多企业仍然沿用传统的低温乙醇工艺，但是经常会遇到制品纯度低、多聚体和热原含量高等问题。因此近年来，许多厂家[4-6]也对此进行了改进，研究结果(表1)表明增加层析步骤制备的HSA纯度更高、杂蛋白含量更低、临床使用安全性更好。研究人员还发现层析法可有效去除HSA制品中的热原、多聚体和杂蛋白含量，进而提高产品的质量[7,8]。 表1 HSA层析法成品检定结果 厂家标 准 纯度 （%） 标 准 多聚体 （%） 原料 北京生物所 ≥ 96% 99.9≤ 5% 0组分 II+III上清液 山东泰邦99.40.5组分IV上 清液 成都生物所99.1 1.3组分IV上 清液 2.2人免疫球蛋白 在血浆中，免疫球蛋白是除白蛋白外含量丰富的一类蛋白,约占血浆蛋白总 量的12％～15％。其中以静脉注射用人免疫球蛋白（human immunoglobulin for
离子交换层析技术 层析（chromatography）也称为色谱，就是将混合物中各种组分分离的方法，是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相，即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时，由于各组分在两相之间的分配比例不同，它们（各组分）就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相可以是固体，也可以是被固体或凝胶所支持的液体。定相可以被装入柱中或涂成薄层、薄膜，成为层析“床”。动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气相层析，或者成为液相层析。 离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以待分离的样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为α球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。