非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)原理、方法步骤与常见问题分析[转]2009-12-09 20:27Native-PAGE原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法
非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制
1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；
2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；
5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH
6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；
6. 10％APS；
7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；
8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O
电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）
1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)
2. 40%胶贮液(40%T,
3.3%C）
4.25ml 0.5ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml
5. 水3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L
电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
染色和脱色:取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。
分离碱性蛋白
要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：
1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，
2.67% C）；
2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（
3.125% T，25% C）；
3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH
4.5
将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂
实验操作同分离酸性蛋白。
SDS-PAGE和Native-PAGE的比较
非变性凝胶电泳，也称为天然凝胶电泳，与非变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：
1. 凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶的有SDS。
2. 电泳载样缓冲液中非变性凝胶的不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。
3. 在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，不像SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。
4. 非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。非变性凝胶电泳中碱性蛋白通常是在微
酸性环境下进行，蛋白带正电荷，需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。
5. 因为是非变性凝胶电泳，所有的电泳时候电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性，而且步骤都要在0-4度的条件下进行，这样才可以保持蛋白质的活性，也可以降低蛋白质的水解作用。这点跟变性电泳也不一样。
所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率
问题和解答
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗？电泳1－2小时再加结合反应产物吗？
预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般３０－６０分钟后加样电泳。2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？
步骤是：
（1）固定：10%冰乙酸min。
（2）清洗：双蒸水冲洗凝胶次，每次1min。
（3）染色：染色液（1g硝酸银，.5mL37%甲醛，1L双蒸水。现配）染色30min。
（4）清洗：迅速洗凝胶次。
（5）显影：30g碳酸钠，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。
成功银染的关键因素包括：
（6）用超纯水（比如，NANOpure或Milli-Q纯化）或者是双蒸水作银染。
（7）用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。
（8）在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，用不超过5-10秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。
（9）甲醛和硫代硫酸钠（ul/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。
（10）在使用前及时配染色液。3. 变性PAGE的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性
PAGE的裂解液.具有操作步骤是什么?非变性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬兰以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。细胞超声即可，超声后离心取上清.也有配NA TIVE-PAGE gel所用buffer为1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。还有一点就是要在配gel时考虑能使蛋
白多聚体稳定的因素。
4. 做了naive---PAGE没有条带，蛋白质是纯品，分子量很大，怎么回事呢？因为分子量很大，8%的胶浓度较合适。加样时加个marker，可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏，如果蛋白是一种酶，且可使某种底物显色的话，可以用活性染色试试，更灵敏。Native-PAGE注意几个问题
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要
的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；
3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;
4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。调整样品的PH在4.0左右，这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外，加入样品后不能加热.
RNA的琼脂糖凝胶电泳 实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA非变性琼脂糖凝胶检测 实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 实验步骤 （1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1×TAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 （3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致28S 和18S 条带分不开。使用2ug 上样量，电压小于6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以DNA 标准为参照，28S 和18S 分别位于2.0kb 和0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测 试剂： （1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。 （4）去离子甲酰胺。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类 有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。 在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部 分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。 1. Blue Native PAGE Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白 质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。 Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移 到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。 1.2 Clear Native PAGE Clear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。 Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示： 表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b 3.51000－2000 460 100 5.080－500 260 65 8.060－400 160 45 12.040－200 70 20 15.025－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30 b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。 聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA 纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。 常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶： （1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶
6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验试剂及配制： a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。 b,变性剂。1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。 C, 固定液。100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。 d, 银染液。硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。 f, 显影液。无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。 DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程 6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。 电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。
固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。 漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍， 每次 2 ～ 3 min。 染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇 动染色 30 ～ 40 min。 显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后 立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显 影直到带型完全出现。 定影:将出现带型的胶板放入固定液中定 影 2 ～ 3 min，再用双蒸水漂洗两次 ( 每次 2 min) 。 干胶:胶板置于室温自然干燥。 带型统计 改良方法：a,银染 0.5%HNO+0.1 %AgNO b,漂洗蒸馏水2-3s C,显影 1.5% NaOH+0.2%Na_CO+0.5%HCHO 2-5 min d, 终止 5%无水乙醇+ 0.5 %HNO1 m后用自来水冲洗1 min。
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及 步骤 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 5. 凝胶显影：
变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验 【实验目的】 掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。 【实验原理】 在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。 【仪器、材料与试剂】 1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。 2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。 3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。 5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至250mL，过滤并排气。 6.染料：40%(W/V)蔗糖，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青和30%甘油。 7.塑料胶框、梳子和垫片，两个用于固定胶框中玻璃片的塑料支架。 8.一有柄和一无柄的两片玻璃板(尺寸：17.78cm 宽×20.32cm 长×0.635cm 厚)，有柄的玻璃板有一个13.97cm 宽，2.54cm 厚的突出。
Native-PAGE原理 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。 实验方法 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。 一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。 工作液配制 1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）； 2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存； 4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存； 5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH 6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；
SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 简介： 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE)，其原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE 凝胶，也可配制非变性(native)PAGE 凝胶，具体配制的量应根据器具大小决定。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制10%过硫酸铵：直接在Ammonium Persulfate 中加入蒸馏水，充分溶解，分装 成小份储存于-20℃或4℃。注意：一般用1.5mlEP 管分装成0.5-1ml 每支，-20℃保存，每支使用2-3次即弃用。短期使用时，可保存于4℃，1周有效。 2、 根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶(下层胶)： 不同浓度的SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围： SDS-PAGE 分离胶浓度 最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 成分 配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积(ml) 编号 名称 PE0018 30T Storage 试剂(A): 30% Acr-Bis(29:1) 100ml 4℃ 避光 试剂(B): 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 100ml RT 试剂(C): 10% SDS 5ml RT 试剂(D): Ammonium Persulfate 0.5g RT 试剂(E): TEMED 2×1ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验 一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 配制溶液： 1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存） 2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月） 3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml） 4、TEMED 5、20-200 DNA marker 6、尿素 实验步骤： 1、配置10%的胶10ml：8M*10ml*60g/mol=4.8g 尿素 6.1ml water 3.3ml 30% Acrylamide 1ml 10 ×TBE 0.11ml APS 0.01mlTEMED 2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。 3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合 的丙烯酰胺。 4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部 的三分之一处，大约需要60-90分钟。 二银染实验 银染溶液的配置：实验之前准备4℃水 1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行） 2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加1.5ml37%甲醛溶液，必须 储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行） 3、显影液：将30gNa2CO3溶解于ddH2O中，冷却至4℃，使用前加1.5ml37%甲醛溶液 （通风厨中进行），0.1M五水硫代硫酸钠150μl；（0.1M Na2S2O3。5H2O：将2.48g Na2S2O3。5H2O溶于100mlddH2O）。 注意事项： 1、染色液和显影液要现用现配； 2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃； 3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作； 4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色； 5、显色不能在透光的盒子中进行； 6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方 一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘； 7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；
电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤 最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂： 1、30％聚丙烯酰胺(29:1) 丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。 2、10％过硫酸胺 过硫酸胺1克，水10ml。 3、TEMED 4、5xTBE Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。 二、银染试剂 1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。 2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。 3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。 4、37％甲醛。 三、配胶(6%)： 30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。室温凝固时间>1小时。 四、银染： 1、固定液固定10m。 2、水洗2m x3次。 3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。 4、水洗 20秒x2次。 5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。 6、水洗若干次，终止显色。 电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。 银染后胶面积将膨胀10％。 在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。 显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！ 聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。 需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。 下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验 测序凝胶的银染
变性梯度凝胶电泳 摘要：变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher 和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其主要是基于突变型和野生型棱酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，利用变性梯度凝胶进行分离, 该手段分辨率达一个碱基。恒定变性凝胶电泳(CDGE)、瞬时温度梯度电泳(TTGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)是由DGGE经改进而成。它们在突变分析上都有着重要的作用。 关键词：变性梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳、温度梯度凝胶电泳 1、前言： 随着结构基因组计划接近尾声，人类基因神秘的面纱已逐步揭开，GenBank中已知基因的数目也与日俱增，各种遗传病的相关基因也了解得越来越多。但是，在找到了候选基因后，还需要在相关的遗传病病人中进行突变检测，只有找到了相应的突变。才能真正确定该基因与疾病的关系，从而服务于临床。变性梯度凝胶电泳就是一种很有实用价值的突变分析方法。该方法经改进，又发展出了恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel elec—trophoresis，CDGE)、瞬时温度梯度电泳(temporaltemperature gradient electrophoresis，TTGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel elec—trophoresis，TGGE)。现在上述方法已经广泛应用于遗传病的诊断、突变分析和肿瘤相关基因的筛查等许多方面。 2、基本原理 2.1变性梯度凝胶电泳 由Fisher和Izrman口3于1983年创立，以后该技术和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段。电泳开始时，DNA在胶中的迁移速率仅与分子太小有关，而一旦DNA泳动到某一点时，即到达该DNA变性浓度位置时，使得DNA双链开始分开，从而大大降低了迁移速率。由于不同的DNA片段的碱基组成有差异，使得其变性条件产生差异，从而在凝胶上形成不同的条带。目前常用的变性荆有尿素(urea)和甲酰胺(formamide)。根据DGGE变性梯度方向与电泳方向是否一致，可将其分为两种形式的DGGE：垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变性梯度方向与电泳方向垂直，可用于优化样本的分离条件，也可用于分析PCR产物的组成；平行DGGE的变性梯度方向与电泳方向一致，可用于同时分析多个样本。检测某种突变的变性剂浓度一般通过变性
凝胶电泳
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论文题目：凝胶电泳 专业：化学 年级：10级 学号：10101550203 姓名：马慧 摘要 凝胶电泳（Gel electrophoresis）或称胶体电泳，也可称为扁平式电泳法，是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。它是以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法，如质谱、聚合酶链式反应、克隆、DNA测序或者 免疫印迹检测之前，进行部分提纯分子。通过学习，了 解凝胶电泳的类别、原理、特点及其应用范围。 关键词：制备，类别，定义，原理，特点，应用范围 正文 一、凝胶制备 1、设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种。其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用比较广泛。核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris?HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris?HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸钠，0.0018mol/L EDTA）。 2、凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。
PAGE 电泳的操作步骤及试剂配方 聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测DNA 序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP （Single Strand Conformation Polymorphism ，单链构象多态性）。 原理：在SSCP 测定中，双链DNA （dsDNA ）被变性成为单链DNA （ssDNA ），每一条单链DNA 都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA 单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA 在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA 的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 SSCP 与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：a ．SSCP 使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺80g ，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺 2.76g ，10×TBE 50ml ，加水定容到1L ）b ．工作环境，由于SSCP 受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V ，电流50mA ，单板电泳功率为9W ，不用预热。缓冲液最好用新配制的。c ．由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C 以下。 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb 的DNA 片段和DNA 序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA 纯度高。在催化剂TEMED （N-N-N ，-N ，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N-N ，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。 1.1配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g 、N-N ，-亚甲双丙烯酰胺1g 、加水至100ML ，40C 棕色瓶可保存1.2配制5×TBE 缓冲液：TRIS 碱54克、硼酸27.5克、EDTA 3.72克、加水至1L 1.3制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积 1.4DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围 丙烯酰胺（%） 有效分离范围（bp ） 二甲苯氰FF 溴酚蓝3.51000-20004601005.080-500260658.060-4001604512.040-200702015.025-150601520.0 6-100 45 12 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤 2.1从NaOH 池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶2.2把玻璃板拿到流动水处洗刷干净2.3洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干2.4用乙醇擦洗玻璃板 试剂制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml ） 3.5 5.08.012.020.030%丙烯酰胺 11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75×TBE 20.020.020.020.020.010%过硫酸铵 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体 现在哪里？ 作者: 墨池(站内联系TA)收录: 2011-07-31 发布: 2011-07-21 1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？ 2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？ 谢谢(*^__^*) 嘻嘻 收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。 2. SRAP（貌似叫什么...相关序列扩增多态性）标记这个应该是非变性PAGE，6%的PAGE胶配方就不用发了吧，google一下一大堆。TEMED和过硫酸铵都是最 Originally posted by holyala at 2011-07-21 2121: 1. 变性胶加尿素或者其他变性剂，非变性胶是不加的。一般做RNA分离或回收、蛋白质分子量测定会使用变性PAGE，而DNA跑PAGE通常是采用非变性PAGE，另外回收活性蛋白也有用非变性PAGE的。 2. SRAP（貌似叫什么...相 ... Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2138: TEMED和过硫酸铵的先后呢？ Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2019: 1 非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶的区别？“变性”体现在哪里？
2 SRAP标记用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，是变性还是非变性？配方是什么？配胶时，过硫酸铵是不是要最后加入？ 谢谢(*^__^*) 嘻嘻 1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。 2.SRAP一般用变性的聚丙烯酰胺，毕竟片段还是比较小。 3.配胶时不用加入过硫酸铵，灌胶前同时加入过硫酸铵(注意有毒！低温保存)和TEMED（也有毒，特臭）。 另外，这些问题貌似分子克隆那本书非常详细，只不过SRAP标记较新而已，没 Originally posted by changes at 2011-07-21 2107: 1. “变性”体现在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素(一般跑DNA)或SDS(一般跑蛋白)，另外，如果样品也要变性(DNA的loanding buffer也与普通的琼脂糖电泳所用的不同，同理所用Marker也不同；蛋白也要变性)。 2.SRAP一般 ... Originally posted by 墨池 at 2011-07-21 2104: 你说SRAP是变性的，我看师姐的配胶过程没有一点体现变性的物质。 非变性胶也可以，但是分辨率会低些。另外，你是用SRAP标记做什么的，多态 Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-22 0727: APS和TEMED虽然不好，但也比不上丙烯酰胺有神经毒性，可随皮肤渗入人体，所以我是什么东西都加完之后最后加丙烯酰胺。 ...额~~话说我们一般都是把丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺配成40%的母液，用的时候根据所需要的浓度加一定量的母液即可。要是每次都搞丙烯酰胺来配，那谁
实验19 总RNA的变性琼脂糖凝胶检测 【实验目的】 掌握总RNA变性胶电泳的原理和方法。 【实验原理】 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。如需快速检测提取总RNA的质量，可用普通的1% (m/V)琼脂糖凝胶监察。 判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到28s rRNA、18s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。 【器材与材料】 1．器材 水平式琼脂糖凝胶电泳系统、电子天平、移液器、Tip头、电炉、紫外透射检测仪 2. 试剂 (1) 0.1% (V/V) DEPC水 200ml 双蒸去离子水加0.2ml DEPC（焦炭酸二乙酯），充分搅拌混匀，室温放置过夜，高压灭菌。 (2) 10×电泳缓冲液 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）0.4mol/L（pH 7.0） NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3) 50mL变性琼脂糖凝胶1% (m/V) 10×电泳缓冲液 5 ml 琼脂糖0.5 g 0.1% (V/V) DEPC水36.5 ml 加热溶解，稍冷却，加入8.5 ml 37%(V/V)甲醛。
(4) 上样缓冲液：50% (V/V) 甘油，1mmol/L EDTA，0.4% (m/V) 溴酚蓝，0.4% (m/V)二甲苯蓝。 (5) 甲酰胺（去离子）。 3．材料 植物或动物的总RNA溶液。 【操作步骤】 1．电泳槽，制胶用具的清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜），水冲洗后用，3% H2O2灌满电泳槽，室温放置10min，用0.1% (V/V) DEPC水冲洗，晾干备用。2．制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5ml的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。 3．加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：2μl 10×电泳缓冲液、3.5ml 甲醛、10ml甲酰胺、3.5μl RNA样品。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。4．电泳：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。 5．电泳结束后通过紫外透视仪观察。 【要点提示】 1. 本实验中必须防止RNase污染，以免RNA降解。所有试剂需用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。 2. RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳与DNA的操作相同。 【思考题】 如何判断RNA提取物的质量？
试剂等 电泳仪、电泳槽、电泳玻璃板（数套）、鲨鱼齿（67空，数条）、边条（数对）、加样枪（1ml、5ml、10μl、100μl、200μl）、脱色摇床、合适大小的托盘数个95%乙醇、冰醋酸、纱布、医用胶布、剥离硅烷和亲和硅烷（鼎国）、10% APS （过硫酸铵）（液体状试剂一周内有效）、TEMED、40%丙烯酰胺（19:1，上海生工）、尿素（进口，amresco），未注明的均为国产分析纯试剂 试剂配制 亲和硅烷：加10μl Bind-Silane（亲和硅烷）于1ml含10μl醋酸的95%乙醇中，混匀后备用。（涂玻璃板用） 固定/脱色液：10%乙醇，蒸馏水配置（可重复用） 硝化液：15ml硝酸/L蒸馏水 染色液：1g AgNO3/L蒸馏水 显色液：30 g Na2CO3/L蒸馏水（温度不可高，否则显色背景深；可预冷，预冷后可延长显色时间，有助于减轻显色背景，一般情况时室温即可，显色约需3～5min） 终止显色液：10%冰醋酸 电泳用的TAE用蒸馏水配制，制胶用的所有试剂均用双蒸水配制。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 制胶及电泳 （1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。 1 用1～ 2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次） 2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）
3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止） 4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分） 5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。 （2）制胶：称取尿素21g，加入17ml双蒸水加热约二三十秒溶解，待冷却后加入10ml 5×TBE，冰浴至冰手时加入7.5ml 40%丙烯酰胺（19:1），然后加入225μl 10%过硫酸铵和50μl TEMED，快速混匀，准备灌胶。 （3）灌胶：用5ml加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢加入到胶板玻璃板之间的空隙，注意不能在胶中形成气泡（要多次实验以掌握技巧、控制加样速度、调节玻璃板倾斜度、手按、竖起玻璃板、便轻敲变加样等）。胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右（不可过深，以免后面不能加样；也不可过浅，以免上样量过小），同时防止梳齿平端下方出现气泡，于室温下静置2h，使胶完全聚合后使用。 （4）预电泳：撕去胶布，两端平行用力拔出梳齿，将玻璃板和梳齿上的多余凝胶擦洗干净，用蒸馏水漂洗玻璃板、梳子。将玻璃板装到电泳槽上，在下方电泳槽中加入1×TBE至没过玻璃板下端约1cm，装好电泳槽，加入1×TBE至没过玻璃板上端约1.5cm处，用梳齿刮去玻璃板间隙间的碎胶，再用5ml加样枪将其吹干净，反转梳齿，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，并用夹子夹紧，梳齿间空隙即为加样孔。120w恒功率，预电泳30min。 （5）点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将梳齿间隙间油状液体吸干净，以利于样品更好的沉降。把DNA样品与上样缓冲液混合，每个加样孔加5~7μl