综 述 ?呼吸系统疾病? 结核菌疫苗的研究进展 徐以民Ξ综述,卢贤瑜审校 (重庆医科大学检验系临床免疫学教研室 400016) 摘 要:世界范围内,结核病疫情急剧恶化,而疫苗可能是根治结核病的最佳甚至唯一途径。但是,目前唯一可用的疫苗BCG的免疫效果不理想。因此,开发安全、廉价、实用、有效的新型疫苗就成为结核病防治的研究热点。目前研究的疫苗主要有蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗和改进的卡介苗以及转基因植物疫苗等。本文概括地分析和介绍了结核病疫苗的研究现状和新近进展,并对疫苗的发展趋势进行了展望。 关键词:结核病;疫苗;免疫应答;转基因植物 中图分类号:R52文献标识码:A文章编号:100623730(2003)0520277202 80年代中期以来,随着人口流动的增加,多重耐药结核病的流行,大量隐性感染者的存在(全球约有20亿人)以及结核分枝杆菌(M TB)和HIV的双重感染,导致结核病(TB)的发病率、死亡率大幅上升。因此,控制和预防TB已成为当务之急,疫苗可能是根治TB的最佳甚至唯一途径。近年来结核疫苗的研究方兴未艾,现就近几年结核疫苗的研究进展作如下综述: 1 减毒活疫苗(live attenuated vaccine)2BCG 111 传统BCG的应用及问题 卡介苗(BCG)是目前唯一广泛应用的活菌疫苗,经临床证实其副作用小,并对幼儿粟粒性结核病和结核性脑膜炎有明显的预防作用;并且又是活菌免疫,免疫效果相对较好,免疫接种也相对简单,易操作。结核病专家屠德华教授认为,在我国对新生儿接种卡介苗是预防结核病的有效手段,保持期可达5年至10年,故近年提倡成人复种。然而对照研究也发现,BCG对预防成人肺结核病效果不理想。研究已证实BCG能预防绝大多数原发性结核,但不能防止传染源的发生。尽管BCG在预防小儿结核发病和防止重症化上曾发挥过相当有效的作用,但对青春期或成人追加接种并未证实能取得如同乳儿期初次接种那样的效果。据报道BCG的预防作用从0～80%不等。其原因可能是BCG菌株的变异使保护性抗原丢失、人群间遗传或营养的差异以及环境等因素的影响,尤其是非典型分枝杆菌的感染,可干扰BCG预防效果的观察。与致病M TB相比,BCG无法充分刺激CD8+T细胞使其达到最佳保护作用。因此,在疫苗的研制中应注意尽可能刺激所有的T细胞群体。 112 改变BCG的免疫途径 BCG最早通过口服液体菌苗进行免疫接种,但用菌量大、效果差,并存在一些副作用。随着菌苗保存条件的及菌种冰冻干燥机的使用,皮内注射及皮上划痕逐渐取代口服免疫。1987年后以使用冻干卡介苗为主。近年,Hoft DF[1]、Lagranderie M[2]等研究发现,对小鼠口服和胃内接种BCG与皮内注射保护作用相同,最近Doherty TM 等[3]将去毒的MPL(单磷酸脂质A)佐剂与二种结核杆菌免疫优势抗原蛋白相结合制备亚单位疫苗,经口服与皮下两种途径免疫小鼠。试验发现,口服途径强化免疫可诱发有效的1型免疫应答,其强度和其保护作用均相当于甚至超过了皮下免疫途径。 113 BCG的修饰和改组 有两方面的思路和研究。一为沿袭BCG疫苗模式,构建减毒活性疫苗,它能使机体免疫系统受到更接近于自然感染途径的刺激,但不会导致病理损害。其方法有(1)通过基因置换和转座子诱变使单个基因位点失活制备疫苗,在预防其它细菌的感染中已有成功的例子。(2)诱导菌株突变,构建减毒株。首先诱导出两种突变,其中一种可影响病原体的致病能力,另一种将导致突变株对某类营养物质有特定的依赖性,然后将两种突变结合运用,就可确保新的候选疫苗更有效、更安全。例如一种依赖亮氨酸生长的分枝杆菌所产生的突变株就不能在免疫缺陷的小鼠体内长久存活,这为免疫功能减弱的人群设计较安全的活菌疫苗提供了一条途径[4]。 另一种方法则是对BCG疫苗本身进行改造重组,恢复表达传代丢失的抗原,并通过设计表达重组的哺乳动物的细胞因子如:IL22、IL24、IL26、IFN2γ、GM2CSF等,以增强其免疫原性[4]。Horwitz MA等[5]将编码结核杆菌的30kD的主要分泌蛋白基因经穿梭质粒导入BCG的Connaught株和Tice株,构建重组BCG,发现重组BCG免疫保护作用优于传统BCG。Jackson M[6]通过经典的等位基因置换技术用BCG1173P2株和结核杆菌M T103株分别构建缺失purC基因的营养缺陷突变株M YC1552和M YC1551,豚鼠试验表明两种突变株与BCG有相同免疫保护作用。 2 亚单位疫苗(subunit vaccine) 减毒活疫苗或灭活疫苗存在许多非必要成分,可引起副作用或存在返祖的可能性,而亚单位疫苗因组成明确、结构简单、安全、特异而受人关注。研究发现刺激免疫反应的M TB 短期培养滤液(ST2CF)蛋白分子主要集中在相对分子量为4 000～11000和26000～35000两部分。研究表明滤液蛋白抗原免疫后经气雾途径感染M TB的豚鼠不但没死,且体重还有所增加,同时显示出对所免疫蛋白很强的DTH反应[7].现已知亚单位疫苗中有明显作用及部分作用的分泌蛋白有: Ag85、ESA T26、MPT232、MPT264以及热休克蛋白HSP65、HSP70等,其中ESA T26及Ag85成为近年研究的特点。 211 ESA T26抗原的研究 ESA T26是从ST2CF分离纯化的分子量为6kD的分泌性蛋白,它存在于M TB中,而所有BCG 菌株均缺失其编码基因。在结核病人和各种动物模型的早期阶段中为介导细胞免疫的优势靶抗原。Brandt E[8]用单磷酸脂质A(MPL)和二甲基2双十八烷基溴化铵(DDA)乳化ESA T26免疫接种小鼠,能引起近似于BCG免疫的较强的特异性T细胞反应。Olsen AW等[9]研究了源于ESA T26抗原的两种肽类后,发现结核感染与ESA T26免疫所诱发的是针对ESA T261～20的反应。随后的试验表明只有源于亚优势肽ESA T2651～70的疫苗,其保护作用与ESA T26及BCG免疫后的水平相同。 212 Ag85B与ESA T26的联合免疫 Olsen AW等[10]用DDA2MPL乳化重组融合蛋白Ag85B2ESA T26和ESA T262 Ag85B合并免疫6212周龄,C57BL/6J小鼠,发现Ag85B2 ESA T26对各种抗原刺激产生的应答最强。后分别用ESA T2 772 国外医学临床生物化学与检验学分册 2003年第24卷第5期 Ξ作者简介:徐以民(1967～),男,山东东营人,重庆医科大学临床检验诊断学博士研究生。研究方向:胚泡植入机制研究、结核疫苗的研制。
综 述 文章编号:100128689(2005)0420250204 抗结核药物的研究进展和发展趋势 Trends and advances i n an tituberculosis agen ts 陆宇 段连山 L u Yu and D uan L ian 2shan (北京市结核病胸部肿瘤研究所, 北京101149) (Beijing T uberculo sis and T ho racic T umo r R esearch Institute , Beijing 101149) 摘要: 结核病是除A I D S 外引起死亡最高的感染性疾病,严峻的结核病回升形势要求加速新型抗结核药物的研究开发。缩短疗程,提高M DR 2TB 疗效及对结核潜伏感染(L TB I )提供更有效的治疗是开发新抗结核药物要实现的目标。口恶唑烷酮类、硝基咪唑并吡喃类等药物是近年发现的新药,利用功能基因组学,蛋白质组学等加速药物筛选、有效传递药物至靶位的药物载体、联合抗结核药物的免疫辅助治疗剂等也是抗结核病药物的发展趋势。 关键词: 结核; 抗结核药物; 药物筛选; 载体中图分类号:R 978.3 文献标识码:A 收稿日期:2004207227 作者简介:陆宇,女,生于1971年,博士,助理研究员。主要从事抗结核药物药理学研究。 结核病是除A I D S 外引起死亡最高的感染性疾 病,是严重的全球性健康问题。抗结核药物是结核病化学治疗的基础,结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。结核病化疗的出现使结核病的控制有了划时代的改变,以异烟肼、利福平、吡嗪酰胺为核心的短程化疗曾取得令人瞩目的成就。人类迈入新世纪的今天,现有的抗结核治疗方案还远远不够理想,严峻的结核病回升形势要求加速新型抗结核药物的研究开发。目前,结核病治疗的两大难题在于结核分枝杆菌的持留性和耐药性,人们对结核分枝杆菌本质认识的逐步深入及新兴技术的发展,为抗结核药物的研究提供条件。现将抗结核药物的研究和发展情况介绍如下。1 开发新抗结核药物要实现的目标[1]1.1 缩短疗程 结核病是结核分枝杆菌引起的感染性疾病,在感染性疾病中结核病的治疗的一大特点是疗程过长。标准短程化疗的前2个月的强化期使患者的菌负荷量大大降低,转为非传染状态,4～6个月的巩固期主要是消除持留状态的细菌以减少复发的危险,至少6～8个月的疗程使患者的依从性难以保证,进而易导致耐药性的发生。在现有抗结核药物基础上进行超短化研究难以达到满意的治愈率和复发率。如果高效的抗菌剂和 或灭菌剂能将疗程缩短到2个月或更短,将大大有利于提高患者的依从性,当然,一种能缩短总疗程并减 少服药次数,服药数量的化合物将是最好的选择。1.2 提高多耐药结核病(M DR 2TB )的疗效 M DR 2TB 的发生率在全球呈上升趋势,M DR 2TB 患者的治疗药物选择受到极大的关注。但是,抗结核新药开发跟不上M DR 2TB 发生速度。目前M DR 2TB 患者的治疗只能应用异烟肼、利福平以外的价格昂贵、不良反应多的二线药物。改进M DR 2TB 的治疗急需新的药物。 1.3 对结核潜伏感染(L TB I )提供更有效的治疗 估计全世界约有20亿的人口感染结核菌,1000～2000万人在一生中发展成活动性结核病。在北美及一些L TB I 发生率低的地区,异烟肼是预防L TB I 的药物,异烟肼也是W HO 推荐的结核病和H I V 双重感染人群的有效药物,但却存在严重的限制性,L TB I 的治疗有待开发新的药物,以利显著降低结核病的发病率。2 抗结核药物开发的困难 在过去的20年,有1200种新药批准上市,但在发展中国家发现用于抗感染的不足1%,至于结核病,在制药工业中的积极性更是与需要不成比例[2]。在美国、欧洲和日本的实验室,对抗结核新药的研究,已从过去的基本静止状态发展到一个活力相当大的时期,但是自利福平问世至今的30年没有一个新型化合物用于抗结核治疗。除缺少商业利益外,开发有活性的新化合物并发展为临床有希望的抗结核药物还有困难。
HPV疫苗的研究进展 摘要：子宫颈癌是引起女性死亡的第二大癌症。研究证实人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）感染与子宫颈癌有着十分密切的关系。近年来，ＨＰＶ疫苗在预防和治疗子宫颈癌方面备受关注，关于HPV疫苗研究已经取得了很大的进展。本文就HPV疫苗的研究进展做一综述。 关键词：人乳头瘤病毒;子宫颈癌;HPV疫苗 Progress in research on human papillomavirus vaccine Zhang Ting(Obstetrics and Gynecology Department of The Third Xiangya Hospital, Central South University ) Abstract: Cervical cancer is the second cause of cancer death in women, many studies confirm that human papilloma virus (HPV) infection and cervical cancer has a very close relationship. In recent years, HPV vaccines get much attention in the fields of cervical cancer prevention and treatment, and great progress has been made in it. This paper focused on the progress HPV vaccine researching. Key Words: human papilloma virus; cervical cancer; HPV vaccine 宫颈癌是导致女性死亡的第2位恶性肿瘤，每年大约死亡50万人。在西方发达国家，宫颈癌筛查方法的有效实施使该病的死亡人数急剧下降[1]，但在那些社会经济不发达的地区，宫颈癌不仅相当常见，而且多为晚期，预后很差。流行病学以及病毒学资料已经证实，HPV 感染与宫颈癌的发生发展有密切的内在联系[2]。分子生物学及免学等多学科的发展及其在动物模型中对HPV疫苗研究取得的进展，进一步推动了HPV（human papilloma virus，人乳头状瘤病毒）疫苗在治疗宫颈癌方面的研究。 1 HPV的地域分布及感染特点 1.1 HPV是含有大约8000个碱基对的双链DNA病毒，并按照其致癌特性分为高危型和低危型，HPV16，18，52，33，45，39等均属高危型，它们与CIN2级与CIN3级密切相关，其中HPV16和18与71%的宫颈癌有关 [3]。HPV16是在所有国家中最为常见的一类，其他类型的HPV的患病率因地理位置的差别而有所差异，如HPV45在非洲西部常见，而HPV39多见于非洲中部及南部。相同基因型的HPV中存在多样的基因组型是与史前时代种族分离进化相关的，这些变异体之间的区别是在其DNA内容物的1%～5%。在墨西哥的人口中HPV16变异体数量和美国、印第安地区相比，比预期的高出很多，相反，HPV18变异体在欧 洲比在非洲常见。 1.2 HPV感染是一个动态的过程，该病毒的自发清除以及多类型HPV联合感染常见。已有证据表明，在性活跃人群中，HPV感染是常见并且短暂的，只有那些长期感染高危型HPV的病人才有罹患宫颈癌的危险，这是因为HPV感染及宫颈癌前病变有较高的自愈能力。目前，已 有一些研究，其目的在于观察HPV感染的自然病程和自发清除率。一项加拿大的调查中发现，HPV16的24个月累计感染率最高(12%)，感染时间最长(平均持续18.3个月)，其次是HPV31(平均感染14.6个月)。一项哥伦比亚研究显示，与其他HPV类型相比，HPV16及其相关基因型(31,33,35,52,58)具有较低的清除率。另有资料显示，非欧洲的HPV16变异体的自发清除率较低，并因此表现出了更强的致癌性。 2 HPV预防性疫苗及其临床试验成果、前景
抗独特型抗体的调节及其应用 摘要：抗独特型抗体是针对抗体可变区的抗原决定簇(独特型)产生的特异性抗体，其中Ab2是初始抗原在体内的“内影像”由于可模拟初始抗原并竞争性抑制Ab1与抗原的结合而广泛应用于疫苗研究、肿瘤免疫、移植耐受、自身免疫病、食品安全等方面，因此对近年采抗独特型抗体的应用进行综述。 关键词：抗体，抗独特型 前言：Jerne，N．K于1974年提出的免疫调节网络学说认为：外来抗原在机体内应答产生的抗体Ab1，同时可刺激产生抗Ab1的第二抗体(Ab2)，并称之为抗独特型抗体。机体免疫系统内的各个细胞克隆，通过自我识别，相互刺激，或相互制约，构成一个动态的网络结构，来调节体内的正常免疫反应。如果该网络结构发生紊乱，则因侵害机体自身而将导致自身免疫性疾病如风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和重症肌无力以及免疫抑制等疾病。机体内存在许多不同基因型并能产生抗体的B淋巴细胞克隆，由于遗传性的差异导致产生的抗体的多样性与不均一性，这种多样性固然与不同的外来抗原本身结构有关，但根据免疫网络学说，机体免疫系统是一个建立在识别自身抗原的基础上来识别外来的抗原的系统。如果外来抗原进入体内，首先能被具有细胞表面受体的免疫细胞克隆所识别，结合抗原后，被活化，分化和增殖，产生抗体以及产生效应细胞和记忆细胞，与此同时，机体内同时存在具有识别这种抗体的免疫细胞克隆，通过免疫细胞之间相互识别V区上的独特型决定簇引发调节机体的免疫反应。 “免疫网络学说”在承认细胞系选择学说的基础上，认为免疫应答并非仅由某个单一克隆细胞的激活而实现。独特型决定簇具有自身免疫原性，体内存在能识别自身独特型决定簇的淋巴细胞。机体接受外来抗原刺激时，能识别外来抗原的淋巴细胞克隆首先被激活，产生针对外来抗原的抗体Ab1，随后能识别某一个克隆独特型决定簇的第2个克隆被激活，产生抗独特型抗体Ab2，依次类推还可以有第3个Ab3，第4个Ab4……。这些克隆相互制约，相互连锁，形成一个闭合型、多层次级联网络。网络的主要作用是抑制抗体的产生，因为只有抑制才能保持机体的免疫自稳状态，使抗体维持在一定水平上。否则，抗体无休止地产生，反而会使机体患免疫病。免疫系统网络学说已经被实验所证明，有力地促进和指导了基础免疫学的研究和发展。独特型(Id)即位于抗体分子可变区的抗原决定簇，是位于抗体可变区内高变区的遗传标志。本质上，Id的差异是由抗体轻链可变区（V l）和抗体重链可变区(V b)内高变区氨基酸序列不同所致。这种氨基酸序列的差异也是抗体特异性的分子基础，不同特异性的抗体分子其独特型也不同。独特型由若干表位组成，称为独特位，它可刺激机体产生相应的抗体，即抗独特型抗体AId。许多实验表明，用抗Id抗体代替抗原免疫动物所产生的免疫应答，能够增强动物对原虫、病毒和细菌感染的抵抗力，作为免疫制剂或免疫调节剂来弥补现有疫苗的不足，或者作为免疫治疗剂治疗肿瘤、自身免疫性疾病，有的用于免疫诊断试剂来建立新的血清学方法。 在疫苗研究中的应用抗独特型抗体Ab2作为抗原的模拟物，可代替病原体，刺激机体产生与抗原特异性抗体具有同等免疫效应的抗体，诱导抗病原体的特异性免疫应答，由此制成的疫苗称为抗独特型疫苗，又称内影像疫苗。迄今为止，抗独特型疫苗主要应用于肿瘤免疫方面。如应用于结肠癌病人,可减缓病情发展、肿瘤的转移并延长病人存活。但与传统疫苗相比，Ab2的免疫原性较弱,因此抗独特型疫苗可与佐剂联用以提高免疫原性，根据不同肿瘤的特性可选择恰当的佐剂。在对结肠癌的研究中发现，抗独特型抗体疫苗与聚核苷酸CPG联用比与完全福氏佐剂CFA联用更能提高抗肿瘤的免疫应答；白细胞介素_6(IL_6)与抗独特型抗体的融合蛋白质可有效地提高体内抗恶性卵巢癌的体液免疫应答，因为IL_6是促进B细胞成熟，增强B细胞功能的细胞因子，也是浆细胞的必需生长因子。近年来，随着对单链可变
单克隆抗体药物研究新进展 单克隆抗体药物，俗称“生物导弹”，是一种具备疾病治疗靶向性治疗的药物，该种药物针对一些对应疾病的治疗具备极强的治疗针对性，往往可以取得较为有效的治疗效果，其整体所占市场份额也比较大。该领域的药品已经慢慢成为一种治疗疾病的主流药物，随着相关研究人员的不断研究推进，其整体呈现一种不断拓宽化的发展。本文从单克隆抗体药物整体的市场情况、靶点及技术三个方面进行全面的研究探索。 标签：治疗性抗体；上市抗体药物；靶点；技术综述 抗体药物的第一次应用是于十九世纪，采用血清疗法针对患者进行相关治疗，在这个阶段人们对抗体药物的认知停留在使用有效的阶段；随着医疗实力的不断发展，直到1975年杂交瘤技术之后，才逐步实现了抗体的更为全面的认知及大规模量产的过程。现阶段随着社会的不断发展，疾病种类也越来越多，治疗起来也越来越麻烦，在这样一种大的背景下，单克隆抗体药物的全面研究和使用，有效的帮助患者进行疾病的靶向治疗和恢复。 一、抗体药物的市场情况 抗体药无是一种具备靶向性，能实现与靶抗原特异性结合来实现对疾病针对性治疗的药物，该种药物在进行使用的过程中，对患者的病症能做到针对性的治疗，具备治疗过程中的安全性治疗及快速准确性治疗。该种药物常常作用与一些恶性肿瘤及免疫性疾病的治疗。因为这些疾病都具备一定的治疗难度，故此药物的出现，可以有效的实现对症治疗，帮助患者进行相关疾病的缓解，因为这样的一种原因，导致在进行相关应用的过程中，该种药物得到了巨大的发展[1]。现阶段，单克隆抗体药物已经成为一种在市场上占据巨大份额的药物，其具备巨大的经济效益，同时帮助患者进行各种疾病的治疗和恢复，其整体已经成为针对疾病进行治疗的有效思路及理论。针对该种药物的扩展，主要是针对一些靶向性进行全面的研究，研究出新的靶点，制造出更多针对更多病症的单克隆抗体药物。 二、靶点研究进展 单克隆抗体药物具备一对一的治疗针对性，其靶点的把控是针对疾病治疗的重要点。世界范围之内，针对新靶点的研究如火如荼。针对热点靶点的研究，主要通过分析世界范围内患者的病症及发病几率进行全面的分类研究，研究出一些有效且具备普遍性的靶点，全面促进单克隆抗体药物的研究和发展。其现阶段世界主要研究靶点分以下几类。 （一）PD-1、PD-L1 PD-1是一种存在于T细胞表面的免疫抑制跨膜蛋白，主要针对癌症进行相关治疗，其主要作用有两点：1.针对慢性感染炎症进行相关限制；2.针对癌症中
抗结核药市场分析 19-20世纪初，结核病给人类带来了巨大的灾难。之后，随着医学的进步，结核病的发病率已降到较低水平。然而进入20世纪后期，结核病疫情卷土重来：耐多种药物结核菌株的出现、免疫缺陷病毒（HIV）感染并发症的传播，导致了医院内病原菌的滋生，成为威胁力极高的慢性传染病。 结核病疫情死灰复燃 进入21世纪后，区域性结核病疫情的死灰复燃，又一次给人们敲响了警钟。 据资料介绍：全球每年新发现结核病患者约1000万人，我国是世界上22个结核病高负担的国家之一，由于人口众多，其感染者居世界第2位，在现阶段，有3/4的患者来自农村及贫困地区。据2000年的调查显示，我国受结核杆菌感染者较多，结核病患者约占了总人口的0.4%左右，其中传染性肺结核患者近200万人，年病死率约为3％。随着我国卫生事业的发展，政府对结核病予以高度的重视，与此同时，抗结核药物市场也吸引了业内商家的目光。 全球抗结核病常用药物市场约占抗感染药物市场的12％，2000年抗结核药物市场为4.7亿美元，并且平均每年以5％的速度递增。安万特、诺华、
惠氏、法莫西和Lupin公司占据了抗结核药物市场份额的59%，此外印度生产商占12％，剩余的29％由较小的厂商拥有。 近两年，国内抗结核常用药物市场呈现出上升趋势，据SFDA南方医药经济研究所时每医药信息公司研究数据表明，2002年，抗结核药物在国内大城市重点医院的用量比上一年增长了18％，估计全国抗结核类药物市场销售额为2亿-2.5亿元左右。 常规品种仍占一定份额 目前，常用的抗结核药品由杭生素、合成药和中药三大类组成，其中有20多种西药为国家基本治疗用药，一线治疗药物主要是异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、利福霉素类等。近几年，氟喹诺酮类也被用于抗结核菌的治疗，在联合治疗中发挥出重要的作用。 链霉素链霉素是1944年由美国瓦克斯曼发现的第一个氨基糖苷类抗生素，抗菌谱广，是最先使用的抗结核菌药物。由于链霉素和其他抗菌药物或抗结核药物联合应用可减少或延缓耐药性的产生，在抗结核联合疗法中显示出较好的效果，目前在许多发展中国家作为抗结核的基础药物，也是结核化疗史上的里程碑药物。
生物技术疫苗的研究进展 摘要：随着分子生物学及重组DNA技术的发展，出现了生物技术疫苗，生物技术疫苗是利用生物技术制备的分子水平的疫苗，包括基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失或突变疫苗、基因工程活载体疫苗、DNA疫苗。 关键词：基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失或突变疫苗、基因工程活载体疫苗、DNA疫苗 1生物技术疫苗 上世纪，常规疫苗的局限性日益明显：原始疫苗不安全，人工灭活疫苗免疫持续时间短，生产成本高，灭活不彻底往往容易散毒；体外培养细菌或病毒容易污染其它病原，长期存在于环境中，难与自然感染动物鉴别，使疾病流行复杂化等[1]。生物技术疫苗是分子生物学发展的产物，是用基因工程方法或分子克隆技术分离出病原的保护性抗原基因，将其转人原核或真核系统使其表达出该病原的保护性抗原，制成疫苗或者将病原的毒力相关基因删除掉或进行突变，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗或突变苗。生物技术疫苗只含有病原的部分组成，而常规疫苗往往是一个完整的病原体，因此生物技术疫苗的最大优点是安全性好，对致病力强的病原更是如此。生物技术疫苗可以降低生产成本，更廉价更大批地生产；易于区分感染动物和免疫动物，由于生物技术疫苗中只含有病原的一种蛋白成份，或者缺失某一蛋白成份，因此通过检测野毒中含有，而生物技术疫苗中没有的病毒蛋白的抗体可以方便地从免疫动物中区分出野毒感染者；利用活载体可制成多价疫苗，达到一针防多病的目的。就其应用前景而言生物技术疫苗的优势在于克服了常规疫苗的大量培养病原微生物、灭活不彻底、活疫苗的毒力返强等缺点；动物机体免疫系统更集中产生免疫应答；有利于制成多价苗和多联苗，简化免疫接种程序；易于工业化生产，可以大幅度降低成本；有利于区分疫苗抗体和野毒感染抗体，不影响疫病的监测与诊断，利于疫病的控制、净化和消灭；使用方便，便于保存等。生物技术疫苗为一种理想疫苗，它只能在细胞中剌激合成抗源，从而引发细胞的免疫应答。与传统疫苗相比，生物技术疫苗还有独特明显的优势：①具备可操作性，如BCG卡介活疫苗，是构成一次免疫产生对多种疾病持久防御的疫苗，将刺激机体对各病原体产生保护性免疫；②安全广泛性，1949 年以来全世界有35 亿人接种BCG,并发症极少，安全性高；③免疫应答范围广，植物可表达动物和人类病原体，一种植物可以同时表达几种抗原；④稳定、成本低，种子或块茎中的抗原可以长期保存而不失去活性，基因疫苗生产成本低，价廉，适宜于广大农村；⑤卫生无病原污染，可直接食用免疫，避免了使用注射器的疾病传染，易于推广，易被人们所接受；⑥经济性好，大规模种植疫苗无需提取纯化过程和冷藏，长途运输方便，种植者也无需反复购买种子和种苗；⑦母体抗体存在时新生儿免疫也是可能的；③易获得多价疫苗，将不同抗原基因的转基因植物进行杂交，很容易获得多价转基因植物疫苗；⑨免疫期持久；⑩能同时使用多种疫苗[2]。 2生物技术疫苗的分类 根据生物技术疫苗研制的技术路线和疫苗组成的不同，目前可分为四大类：①基因工程亚单位苗②基因缺失苗或突变苗③活载体苗④DNA疫苗⑤合成肽疫苗。 各种生物技术疫苗的性质见表[3] 项目基因工程亚基因缺失或活载体苗DNA苗合成肽疫苗
志,２０１１,８(２):１４７Ｇ１４９． [２３]俞小飞,徐燕,张梦．妊娠高血压患者与DＧ二聚体二维生素B１２二血清同型半胱氨酸的关系[J]．医学检验与临床,２０１５,２６(４):６１Ｇ６２,２４． [２４]郭跃丽,奚经巧,孔万仲,等．妊娠期H c y和凝血相关指标与胎儿生长发育的临床研究[J]．中国妇幼健康研究, ２０１６,２７(２):２１０Ｇ２１３． [２５]黄华,梁红梅,罗奇智,等．孕妇血清同型半胱氨酸二叶酸二维生素B１２水平与妊娠高血压综合征关系探讨[J]．国际 检验医学杂志,２０１４,３５(２１):２８６９Ｇ２８７１． (收稿日期:２０１７Ｇ１０Ｇ２４一修回日期:２０１８Ｇ０１Ｇ０５) 综一一述 外泌体在肺结核中的研究进展? 李志强１综述,张俊爱２?审校 (１．广东医科大学医学检验学院,东莞５２３８０８;２．广东医科大学广东省分子诊断重点实验室,东莞５２３８０８)一一摘一要:目的一外泌体可由几乎所有类型细胞产生并释放,其被发现存在于多种体液中,包括血液二尿液二唾液二胸腔积液和支气管肺泡灌洗液(B A L F)等.外泌体含有的组分在不同生理病理条件下不同,外泌体在调节细胞功能及疾病发生中扮演重要角色.外泌体在细菌组分传播中起重要作用.本文阐述了外泌体的研究背景二外泌体的形成和分泌二外泌体与结核分枝杆菌(MT B)的相互作用.旨在为结核疫苗和诊断靶标的研究提供新的思路. 关键词:外泌体;一结核分枝杆菌;一巨噬细胞;一疫苗;一诊断 D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．０９．０２５中图法分类号:R５２９．３ 文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)０９Ｇ１１０７Ｇ０６文献标识码:A 一一外泌体是释放到细胞外的直径为４０~１００n m膜性胞外囊泡(E V s),可运载多种蛋白质二脂质及核酸,是一种重要的细胞间信息传递载体[１].结核分枝杆菌(MT B)是肺结核的主要病原菌,作为一种兼性胞内寄生菌,通过感染巨噬细胞为自身创造适宜繁殖环境.MT B在感染后期能诱导宿主细胞死亡以促进胞内M B T外排,也可通过坏死的感染细胞碎片或凋亡小体的释放将致病成分散布到胞外环境.这些外泌体不仅携带各种病原体相关分子模式(P AM P s),还包含T二B细胞抗原蛋白,核酸和病原体相关毒素.根据产生机制不同[２],胞外囊泡分为３类:外泌体二微囊泡和凋亡小体.根据国际外泌体协会建议,文献中所认为的外泌体往往是各种囊泡的混合物,以往多数研究中囊泡纯度并无严格明确,囊泡群中可能包含外泌体,微囊泡甚至细菌胞外囊泡,因此,本文采用 外泌体 一词包括其他类型来源胞外囊泡.本文阐述了MT B感染细胞来源外泌体的免疫调节作用,及其作为结核疫苗和诊断靶标的新思路. １一外泌体的研究背景 一一 外泌体 一词最初由J O H N S T O N E等[３]在研究网织红细胞成熟过程中囊泡形成时提出.R A P O S O 等[４]发现E B病毒转化人B淋巴细胞源囊泡表面表达主要相容性复合体,具有激活免疫系统作用,与红细胞外泌体形成和释放途径相似,这极大激起研究者对外泌体免疫调节作用的研究热情.定义外泌体在免疫应答中的作用的相关研究大多数在自身免疫和癌症生物学背景下进行,而阐述外泌体对感染性疾病如肺结核感染的免疫作用的研究少之又少.在对鸟分枝杆菌的研究中,B E A T T Y等[５]观察到鸟分枝杆菌感染过程中相关P AM P s如脂阿拉伯甘露糖(L AM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(P I M)从吞噬小体被转运至 多囊体并释放到胞外,可在相邻未感染细胞检测到这些P AM P s.观察到鸟分枝杆菌二卡介苗或MT B感染巨噬细胞释放的囊泡含有L AM二糖肽脂和相对分子质量为１９?１０３的脂蛋白等MT B组分,流式细胞术检测发现囊泡释放量与多种内体标志物(包括L AM P１二L AM P２二MH CⅠ二Ⅱ和４次跨膜蛋白C D８１)的数量呈正相关[６Ｇ７].这些具有晚期内体标志物的囊泡通过钙依赖性胞吐释放到胞外,暗示这些囊泡属于外泌体[８].P R A D O SＧR O S A L E S等[９]发现MT B可释放带有菌体成分的胞外囊泡,可引起T o l l样受体(T L R)依赖性免疫应答.研究发现,感染细胞分泌的胞外囊泡中含有脂聚糖与脂蛋白标记的MT B胞外囊泡和C D９二C D６３标记的宿主源性外泌体,但有部分细菌组分掺入宿主外泌体,提示外泌体可作为MT B胞外囊泡运输的次要途径[１０].MT B感染细胞释放的胞 ７０１１ 国际检验医学杂志２０１８年５月第３９卷第９期一I n t J L a bM e d,M a y２０１８,V o l．３９,N o．９ ?基金项目:广东省医学科学基金项目(A２０１６６０６３二A２０１８４３４７);广东医学院面上培育项目(M２０１５０２１);广东医学院大学生创新实验项目(２０１６Z Z D C００３二２０１６Z Y D G００２);国家大学生创新创业训练项目(２０１６１０５７１０１９). ?一通信作者,EＧm a i l:z h a n g j u n a i＠g d m u．e d u．c n. 一一本文引用格式:李志强,张俊爱．外泌体在肺结核中的研究进展[J]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(９):１１０７Ｇ１１１２．
2009年第1期畜牧兽医科技信息国兽医科学,2007,37(1):29-32 [9]李余动,等.胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留[J].中国食品卫生杂志,2005,17(5):416-419 [10]张明,等.免疫胶体金法检测磺胺甲恶唑残留的研究[J].中国兽药 杂志,2006,40(4):17-24 [11]邓省亮,等.胶体金免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究 [J].食品科学,2007,28(2):232-236 [12]Sun Xiulan,et al.Preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin B1[J].International Journal of Food Microbiology ，2005，99(2):185-194 [13]赖卫华,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A 的研究[J]. 食品科学,2005,26(5):204-207 [14]Timo Klewitz,et al.Immunochromatographic assay for determina tion of botulinum neurotoxin type D[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2006,113(2):582-589 1975年德国学者Kohler 和英国学者M ilstein 发明了杂交瘤技术。他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、 人源化抗体、人源性抗体4个发展阶段。近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。1 单克隆抗体的研究进展 1.1鼠源性单抗自单克隆抗体制备技术问世以来，制备单抗的一般程序基本相同，从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK 等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥AD-CC 作用的时间较短； 其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。 1.2嵌合抗体抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性 最强的部位，而决定抗体特异性的是抗体的可变区。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区的基因连 接,再插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAM A)。 1.3人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多,主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(complementarity determining region,CDR)移植，将鼠抗体的CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surface amino acid residues,SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。 1.4人源性抗体虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原 性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。1.4.1 噬菌体抗体库技术 噬菌体抗体库技术是迄今发展 最成熟、 应用最广泛的抗体库技术。其基本原理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。通过这种方式,形成了一个收藏上亿个以体外方式制得的不同抗体的基因数据库,使从任何真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。分离得到的抗体可用于 单克隆抗体及其应用的研究进展 孔 维1，杨文辉2 （1.东北农业大学动物医学院，哈尔滨150001；2.哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨150300） 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000作者简介：孔维（1979～），湖南平江人，硕士研究生 专论与综述 9
口蹄疫 最流行的血清型是O、A和亚洲1型。 FMDV为无囊膜、二十面体对称的病毒粒子。 完整的衣壳蛋白：VP1-VP4，VP1是决定感染、免疫的核心蛋白。 FMDV可在幼仓鼠肾细胞（BHK）上增殖，也可在IB-RS-2猪肾细胞上繁殖，肾细胞或其他牛的甲状腺细胞（BTY）对FMDV特别易感。 流行病学 易感动物：偶蹄兽。从猪体内分离的毒株对猪有高度致病力，而牛则不易感；人也感染，但人主要为FMDV的传播者，对人类本身的致病性甚微，在大量的人的病例中，水疱病变通常由人的肠道病毒如手足口病病毒引起。 传染源：患病动物和带毒动物，病愈动物可长期带毒。 传播途径：消化道、伤口、呼吸道、精液。可发生远距离跳跃式传播。 本病的流行特点是：传染快、流行广、发病率高，同一时间内，往往牛、羊、猪一起发病。也有牛、羊发病，猪少 发或不发；或只有猪发病，牛羊少发或不发。 一年四季均可发生，但寒冷时易发，夏天少。 猪主要症状表现在蹄部。蹄冠、蹄叉、蹄踵、鼻盘出现水泡；齿龈、舌、颚部等也出现水泡。少数母猪的乳房、乳头皮肤发生水泡。仔猪发病重，主要发生急性胃肠炎和心肌麻痹而死。仔猪病死率60%以上。 猪O型口蹄疫是持续引发和维持我国O型FMD的最主要的原因 防治现状 1)流行态势严峻 —3种主要家畜跨种间传播，加快了病原生态在宿主嗜性和致病性方面的适应性变异 2)新毒株不断传入、流行毒株变异 —May98、Asia1/JS/2005、A/HBWH/09(G1)、A/GDMM/2013(G2)、PanAsia和新猪 毒-2 3)病毒对环境污染严重 —疫情隐瞒不报，流行病学数据不准 —病畜及康复畜广泛存在，无法灭源 —带毒动物及污染产品广泛流通与贸易，难以阻断传播途径 4)过分依赖疫苗免疫 —疫苗免疫不能完全阻断感染或清除病毒 —疫苗应用策略欠妥，普遍使用疫苗导致新发疫病成为常在疫病 5)养殖模式所形成的生物安全风险依然存在 —散养、小规模等 6)早期监测预警机制不完善 7)免疫防控的长期性 综上，我国仍是受口蹄疫危害最严重的国家之一 据统计，我国每年因FMD造成的损失平均在110-120亿元之间，约占畜牧业平均增 加值增量的17%-18%。
抗体药物的研究现状和发展趋势 一、研究现状 1．抗体研究发展历程 抗体作为药物用于人类疾病的治疗拥有很长历史。但整个抗体药物的发展却并非一帆风顺，而是在曲折中前进。第一代抗体药物源于动物多价抗血清，主要用于一些细菌感染性疾病的早期被动免疫治疗。虽然具有一定的疗效，但异源性蛋白引起的较强的人体免疫反应限制了这类药物的应用，因而逐渐被抗生素类药物所代替。第二代抗体药物是利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体及其衍生物。单克隆抗体由于具有良好的均一性和高度的特异性，因而在实验研究和疾病诊断中得到了广泛应用。 单抗最早被用于疾病治疗是在1982年，美国斯坦福医学中心Levy等人利用制备的抗独特型单抗治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者病情缓解，瘤体消失，这使人们对抗体药物产生了极大的期望。1986年，美国FDA批准了世界上第一个单抗治疗性药物——抗CD3单抗OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。此时抗体药物的研制和应用达到了顶点。随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显。同时一些抗肿瘤单抗未显示出理想效果。人们的热情开始下降。到20世纪90年代初，抗毒素单抗用于治疗脓毒败血症失败使得抗体药物的研究进入低谷。由于大多数单抗均为鼠源性，在人体反复应用会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，从而降低疗效，甚至可引起过敏反应。因此，一方面在给药途径上改进，如使用片段抗体、交联同位素、局部用药等使鼠源性抗体用量减少，也增强了疗效；另一方面，积极发展基因工程抗体和人源抗体。 近年来，随着免疫学和分子生物学技术的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA 重组技术开始用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造以消除抗体应用不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备各种形式的重组抗体。抗体药物的研发进入了第三代，即基因工程抗体时代。与第二代单抗相比，基因工程抗体具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②基因工程抗体的分子量较小，可以部分
论人源化单克隆抗体的研究进展 *** （生物工程一班生命科学学院 ***大学哈尔滨 150080） 摘要：自从单克隆抗体问世至今已广泛应用与临床治疗，然而鼠源性单克隆抗体在临床治疗中会产生人抗鼠抗体反应，从而使鼠源性单克隆抗体的应用受到极大限制。随着基因工程技术和抗体工程技术的迅速发展，人源性单克隆抗体开始快速发展而逐渐代替鼠源性单克隆抗体。本文将就人源化单克隆抗体的构建以及其在临床治疗方面的应用进行综述。 关键词：单克隆抗体人源化临床治疗 Theory humanized monoclonal antibody research progress *** (The 1st class of Bioengineering , College of Life Science, *** University, Harbin, 150080) Abstract: Since the advent of monoclonal antibody has been widely applied in clinical treatment, but the mouse source sex monoclonal antibodies in clinical treatment will produce people resistance to mouse antibody response, so that the rat source sex monoclonal antibody application are highly limited. Along with the genetic engineering technology and the rapid development of antibody engineering technology, humanized sex monoclonal antibody began to rapid development and gradually replaces the rat source sex monoclonal antibody. This paper will review humanized monoclonal antibody construction and the application of clinical treatment in this article. Keywords: monoclonal antibody humanized clinical treatment 1975年。Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞机能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术[1]，此后单抗药物开始迅速发展并广泛应用于临床。1982年，Philip Karr 将第一株抗独特型单抗(anti- ld) 应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功[2]，使得治疗性抗体的研究很快成为生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，鼠源性单克隆抗体应用于人类有较强的免疫原性，能诱发人抗鼠抗体( Human ant-i mouse antibody, HAMA) 反应，引起强烈的免疫排斥反应[3]，而且鼠源性单克隆抗体不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用。这使研究学者意识到研制鼠源性单克隆抗体人源化或完全的人源性抗体才有可能减少或避免HAMA反应并提高疗效。然而反复实验证明, 杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。直到80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一