柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析
孙大光;郑雪芳;刘波;阮传清;夏育陆;段永平
【摘要】Nested-PCR detection of Shunchang citrus Huanglongbing pathogen was carried out in this study. Phylogenetic tree based on rDNA sequencing was built to find out the evolutionary between different parts citrus HLB pathogens. Digesting the target DNA fragment of 16S rDNA with restriction enzyme Xbal was carried out to confirm the species of Shunchang Huanglongbing pathogen. The results showed that there were 7 positive detections in 12 selected samples, and the rate of positive detections was 58.33%, and four were dominant character, three were recessive character. The results showed that Shunchang citrus Huanglongbing pathogen belong to Candidatus Liberibacter asiaticus based on the 16S rDNA phylogenetic analysis and restriction enzyme Xbal digestion analysis. And 16S rDNA sequence gap analysis showed that the difference between Ca. L. Asiaticus and Ca. L. Africanus, Ca. L. Africanus and Ca. L. Americanus, Ca. L. Americanus and Ca. L. Asiaticus were 2.75%, 3.90%, 3.44%, respectively.%采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化
分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为
3.44％.
【期刊名称】《福建农业学报》
【年(卷),期】2011(026)006
【总页数】7页(P1027-1033)
【关键词】柑橘黄龙病;鉴定;16S rDNA;系统进化分析
【作者】孙大光;郑雪芳;刘波;阮传清;夏育陆;段永平
【作者单位】福建师范大学生命科学学院,福建福州350108;福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心,福建福州350003;福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心,福建福州350003;福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心,福建福州350003;福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心,福建福州350003;美国北卡州立大学有害生物综合治理研究中心,北卡罗来纳罗利27606;美国农业部佛罗里达园艺实验室,弗罗里达皮尔斯堡34945
【正文语种】中文
【中图分类】Q931
柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，简称HLB），又称柑橘青果病（Citrus greening disease），是柑橘生产中最严重的病害之一［1］。柑橘黄龙病病原菌是一种只限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌，属于变形菌门的α亚群，根据病原的热敏性、传播媒介等可以将其分为亚洲种、非洲种和美洲种。我国的黄龙病病
原为亚洲种［2］。由于柑橘黄龙病病原菌是一种难以人工培养的细菌［3］，症
状复杂，易与一些生理性病害混淆，植株感病后潜伏期长，症状明显时，病树已濒临死亡。因此建立一套准确、灵敏、快速的柑橘黄龙病早期诊断技术对防治该病害具有重要意义。
长期以来，叶片黄化或斑驳症状是柑橘黄龙病田间诊断的主要依据，然而上述典型症状会受到环境条件的影响，从而造成柑橘黄龙病诊断的不准确［4］。虽然电镜和抗血清等［5］手段也曾用于柑橘黄龙病病原菌的检测，由于种种原因还是难以准确地用于检测柑橘黄龙病病原。聚合酶链式反应（PCR）技术因具有准确、快速、灵敏等特性，被广泛应用于柑橘黄龙病病原菌的检测［6－8］。自20世纪90年代Planet等［9］报道利用PCR技术检测柑橘黄龙病以来，人们不断改进和优化
这一技术。Subandiyah等［10］对柑橘黄龙病病原16SrDNA序列进行成功测序；Fang Ding等［11］通过构建系统进化树对我国不同地区柑橘黄龙病病原进行了
分类；廖晓兰等［12］应用实时荧光PCR技术检测柑橘黄龙病病原菌。
Nested-PCR［8］检测柑橘黄龙病病原菌的灵敏度比常规PCR高，利用Nested-PCR技术可以检测出10－8稀释倍数，低于fg数量级［6］的DNA分子。本文
应用Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原菌，对柑橘黄龙病病原菌的16SrDNA 基因进行测序分析，构建不同地域来源的柑橘黄龙病病原菌系统进化树，并对不同类型黄龙病病原菌的16S rDNA序列进行差异性分析，旨在为柑橘黄龙病的早期
诊断提供一种稳定、可靠的检测技术。
柑橘样本采集：于2010年7月23日在顺昌北门水库边赵氏园艺技术研究所果树基地（东经117.8°，北纬26.8°）进行样本采集；随机选择红心柚（Citrus grandis）12株，分别在12株植株上取12片叶片，并记录样品症状。置于4℃
冰箱保存备用。试剂与仪器：CTAB、β－巯基乙醇、异戊醇、氯仿、引物（博尚
公司合成）、PCR仪（Bio-Rad）、电泳仪（Bio-Rad）、UVP凝胶成像系统等。
1.2.1 柑橘叶脉总DNA的提取采用改良的CTAB法提取叶脉总 DNA［6］。
1.2.2 柑橘黄龙病病原菌鉴定采用Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原，Nested-PCR检测引物由美国农业部佛罗里达园艺实验室提供，是根据柑橘黄龙
病病原菌的16SrDNA基因序列设计合成，引物序列和扩增程序见表1。以本实验室现有红心柚黄龙病叶片DNA作为阳性对照，红心柚健康叶片DNA为阴性对照。25μL的扩增体系中含有1U Taq 酶，2.5μL 10×PCR Buffer，0.5μL 10 mmol·L
－1 dNTP，1μL 10μmol·L－1引物和25 ng DNA模板，每个反应重复3次。第二轮PCR扩增的模板为第一轮扩增产物的100倍稀释液。扩增产物在电压90V，1.5%琼脂糖凝胶电泳1h。
1.2.3 柑橘黄龙病病原菌16SrDNA的序列测定分析将Nested-PCR扩增获得的
柑橘黄龙病病原菌的16SrDNA基因特异条带进行切割、纯化，送至上海博尚生物有限公司进行序列测定，并将序列录入到Genbank，通过Blast在线比对进行同
源性分析。为了进一步验证黄龙病病原菌是亚洲种，采用国际上通用的黄龙病病原菌特异引物OI1和OI2c扩增16SrDNA片段，并用限制性内切酶XbaI对扩增片
段进行酶切。
1.2.4 柑橘黄龙病病原菌的16SrDNA序列进化树构建从GenBank中获取不同来
源的柑橘黄龙病病原的16SrDNA序列，参考Fang Ding等［11］的方法，将不
同来源的柑橘黄龙病病原的16S rDNA序列用Clustalx 1.83软件进行多序列比对，并用MEGA 4.0软件分析比对的结果，使用最大简约法（Maximum parsimony）构建系统进化树，Bootstrap value依据1 000次重复计算。
1.2.5 不同类型柑橘黄龙病病原16SrDNA的序列差异性分析应用 DNAMAN version 5.2.2.0软件对本研究中获得的柑橘黄龙病病原16SrDNA序列与Genbank中的获取的黄龙病病原的亚洲种（登录号：AB038369）、非洲种（登录号：L22533）和美洲种（登录号：AY919312）的序列进行多重比对，
分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性。
采集得到的12份样品中，共有7个样品携带柑橘黄龙病病原（图1），阳性对照和携带有黄龙病病原的叶片DNA均扩增出1条440bp的目的片断，而阴性对照
和没有携带黄龙病病原的叶片DNA均未扩增出相应的条带。黄龙病原阳性检出率为58.33%，其中4份叶片表型为黄化或斑驳，经检测携带黄龙病原，为显性性状；3份叶片表型为正常无黄龙病症，经检测也携带黄龙病原，为隐性性状。
将7株黄龙病病原16SrDNA进行测序，获得的16SrDNA序列完全相同，序列长度为440bp（图2），将序列登录到 Genbank （表4），通过Blast同源序列检索，结果在亲缘关系相近的前100个序列都为柑橘黄龙病病原亚洲种，同源性达
到99%，初步推定本试验检测到的柑橘黄龙病病原为亚洲种。
引物OI1和OI2c扩增及限制性内切酶XbaI对扩增片段进行酶切结果表明，OI1
和OI2c扩增的16SrDNA片段大小为1 200bp（图3），扩增出的16SrDNA片
段经过限制性内切酶XbaI处理后，得到大小分别是650bp和550bp的DNA片
段（图4）。
用Clustalx 1.83软件将本试验获得的柑橘黄龙病菌16SrDNA序列与GenBank
中的3条亚洲种（AB038369、AB008366和L22532）、2条非洲种
（AF137368和L22533）和1条美洲种（AY919312）及1条土壤杆菌（Agrobacterium sp；AY528932）的16SrDNA序列进行多重序列比较后，用MEGA 4.0软件最大简约法构建了系统发育树（图5）。该系统树将本试验获得
的柑橘黄龙病病原16SrDNA序列（JN168868）与3个亚洲种聚在同一个类群中。
（1）对本研究中获得的柑橘黄龙病病原序列与Genbank中的获取的黄龙病病原
的亚洲种（登录号：AB038369）、非洲种（登录号：L22533）和美洲种（登
录号：AY919312）的序列进行多重比对，结果如图6所示，这3种不同类型黄龙
病病原序列存在一定的差异性（图中阴影部分表示3种不同类型黄龙病病原序列在该位点的差异碱基），差异性为2.14%。
（2）亚洲种与非洲种，差异性为2.75%，分别是第28bp和353bp位点，非洲种缺失碱基“G”，第59、224、410、412和433bp位点发生碱基颠换，分别是（T／C）、（C／T）、（G／A）、（A／G）和（G／A）。
（3）亚洲种与美洲种的差异性为3.44%，有12位点发生碱基颠换，分别第28、134、176和433bp发生G／A碱基颠换，第72、85和99bp发生T／C碱基颠换，第411和413bp发生T／G碱基颠换，第59bp发生G／T碱基颠换，第224bp发生C／T碱基颠换，第281bp发生A／G碱基颠换，第115和412bp 发生A／T碱基转换，第414bp位点美洲种缺失碱基“A”。
（4）非洲种与美洲种的差异性为3.90%，有3个位点发生碱基缺失，分别是
28bp位点非洲种缺失碱基“A”，353bp位点非洲种缺失碱基“G”，414bp 美洲种缺失碱基“A”，9个位点发生碱基颠换，分别是85bp （T／C）、99bp （T／C）、134 bp （G／A）、176bp （G／A）、281bp （A／G）、410 bp （A／G）、411bp （T／G）、412bp （G／T）和413bp（T／G），2个位点发生碱基转换，分别是59和115bp发生A／T碱基转换。
柑橘黄龙病的田间诊断只是初步判断柑橘是否感染黄龙病，然而有些原因如缺素［13］、天牛危害［14］等造成柑橘的病症会和柑橘黄龙病症状相混淆，因此柑橘黄龙病田间诊断并不能确定其是否携带有柑橘黄龙病病原菌。随着现代分子技术的发展，越来越多的手段可用于柑橘黄龙病病原的检测。本研究采用Nested-PCR技术对12株柑橘进行黄龙病病原检测，病原菌的阳性检出率为58.3%。结果表明柑橘黄龙病发病状态具异质性，或者说不同柑橘叶片对黄龙病病原菌的抵抗能力有差异，柑橘黄龙病病原入侵柑橘叶片的途径有所差异。
通过对比不同样品柑橘黄龙病病原检测结果和表面症状之间的关系表明，样本中黄
化叶片都带有柑橘黄龙病病原，而有些无柑橘黄龙病症状叶片的柑橘黄龙病病原检测结果却呈现出阳性。这说明有些叶片不表现出典型的黄龙病病症，并不代表叶片内没有黄龙病病原，谢钟琛等［15］研究表明，柑橘黄龙病的潜伏期为6～18个月，所以在部分无黄龙病病症叶片中可以检测出柑橘黄龙病病原菌的存在。本研究对不同样品柑橘进行黄龙病菌鉴定与之结论相同，并发现采集到的黄龙病叶片，尽管有的为隐性、有的为显性，其16SrDNA序列完全相同，表明侵染的病原无分化，表型差异只是病程的差异。
丁芳等［16］研究表明，中国7省区的9个柑橘黄龙病病原菌分离物均属于亚洲
菌系。Siti Subandiyah［17］和 Kenta Tomimura［18］等分别对日本，菲
律宾等亚洲国家的黄龙病菌进行检测，得知这些国家的黄龙病菌均属于亚洲型。本研究将顺昌7个样品的黄龙病病原菌16SrDNA序列在NCBI网站比对（Blast），并采用国际通用鉴定黄龙病病原为亚洲种的方法，对黄龙病病原的16SrDNA进行限制性内切酶XbaI酶切，酶切后为650bp和550bp两条片段，而非亚洲种的黄龙病病原不会有这样的现象［19］，结果证明顺昌红心柚黄龙病病原菌属于亚洲种，与董鹏［20］和丁芳［16］等的研究结果相一致。Coletta Filho［21］和Monique［22］等研究已对不同种柑橘黄龙病病原分析做了系统进化分析，本研
究通过JN168868序列与不同地区柑橘黄龙病病原16SrDNA的比对分析和系统
进化分析，得知JN168868与亚洲型柑橘黄龙病病原的同源性高于非洲型和美洲型。
顺昌柑橘表现的斑驳黄化和均匀黄化症状与柑橘黄龙病症状十分相似，本研究表明斑驳黄化和均匀黄化症状的柑橘中都可以检测出柑橘黄龙病病原，并且都是属于亚洲种，为明确顺昌柑橘黄龙病的发生情况以及进一步的黄龙病检测工作奠定基础。
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16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.4 10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避
柑橘黄龙病为什么可怕？那是因为你没有深刻了解它！ 黄龙病就像悬在橘农头顶上的一柄利剑，经历过的往往鲜血淋漓，心有余悸；未曾经历过的亦是提心吊胆，草木皆兵。长期以来，人们对它的恐惧似乎都未曾有过半分消减！ 何惧之有？是因为它传播迅速、毁灭性强？还是因为它诊断困难、用药无方？仔细想想，这些或许都不是主因。 洛夫克拉夫特曾说过，人类最古老而强烈的情感便是恐惧，而恐惧来自未知！我们惧怕黄龙病是因为上述那些标签吗？不，只是因为我们对它还不够了解，担心某一天头上的这柄利剑会突然下坠，担心不知何时它又会再度悬起。 一、什么是黄龙病？ 黄龙病是一种细菌性病害，病原菌为革兰氏阴性菌，属于变形细菌门，α–变形细菌亚纲，根瘤菌目，根瘤菌科。 病原菌一般寄存在柑橘韧皮部筛管细胞中，在柑橘生长的整个阶段都有可能发病，有一定的潜伏期。 二、黄龙病的传播途径 人为传播：带病接穗嫁接、带病苗木调运 自然传播：携菌木虱叮咬 三、黄龙病的主要危害 果实：果小、畸形；着色异常如红鼻子果、青头果等；表面无光泽。 叶片：斑驳黄化、均匀黄化、缺锰、锌状黄化。 根系：表皮易脱离、腐烂，饥饿状，直至死亡。 四、黄龙病的田间识别 主要通过病叶、病果为参考依据。 均匀黄化：此症不典型，不能但作为黄龙病的判断依据，因缺素、根系受损、农事操作不当如环割过度等都可引起此情况。(缺锌、锰状黄化同理) 斑驳黄化：比较典型，斑驳是由于黄龙病病菌在柑橘叶片中逐渐积累引起叶脉韧皮部坏死所致，如果是单纯的缺素症通常是对称的。 红鼻子果、青头果等：最为典型，是黄龙病田间诊断的主要依据。
注：对于疑似病例，拿不准的情况下建议送检，注意拿显症比较明显的枝条送，以免影响检测结果。 五、黄龙病的发生流行的原因 ①柑橘扩种迅速，无病健康苗木已远远不能满足生产的需求，苗木市场混乱不堪，带病苗泛滥。 ②忽视木虱的防控，或不注意统防统治。 ③柑橘价格震荡后，果农植保投入下降，病虫防治不力。更有甚者弃园不顾，之后这些果园很可能成为木虱的天然养殖场。 ④病树处理欠科学，忽视砍前、砍后工作，并没有真正做到去除病原。 ⑤对黄龙病缺乏了解，错把黄龙当黄化，祸害一方。 六、目前黄龙病为什么还治不好？ ①病菌存在于韧皮部中，一般药物很难到达。同理，我们说柑橘溃疡病一旦感病终身带病，也是由于无法根除潜藏在叶肉细胞间隙的柑橘溃疡病菌，而导致其复发率极高。 ②黄龙病病菌目前无法人工培养，固难以进行特效性药物的筛选，暂时处于无药可医的境况。 七、给病树打针能治黄龙吗？ 打针并不能治疗柑橘黄龙病，针里一般是是抗生素类药物+营养物质。 抗生物类药物对于细菌的生长和繁殖虽有一定的抑制作用，但却没有杀灭效果。 你看到的黄树“复绿”仅仅是因为营养物质暂时缓解了缺素症状，之后病树又会再黄回来的。 八、柑橘被木虱叮咬后一定会染黄龙病吗？ 木虱能传菌有两个必要条件，其一，木虱需要带菌；其二，木虱传毒是需要一定时间的。 基于以上两点，柑橘被木虱叮咬不一定会感染黄龙病，但发现木虱后应予以高度重视，宜选用高效、速效的药物如甲氰菊酯+噻虫嗪等立即喷施。 此外，柑橘木虱对于幼嫩组织有偏好，所以每批梢都要防好。 九、黄龙病树该如何处理？ 砍树前：药剂清园，防止木虱迁飞转移，危害健树。 砍树后：处理病兜，最好是连带树根挖掉。也可在树兜上倒上柴油，用黑色塑料袋覆盖挡光，防止树兜重新发芽，最后翻土盖住整个树兜。
1、应用Nested PCR技术检测柑桔木虱及其寄主九里香的柑桔黄龙病带菌率 应用PCR 及Nested PCR技术检测柑桔木虱及其寄主九里香的结果表明:PCR 只可检测最低2头带菌木虱,Nested PCR可检测到单个带菌木虱.100头带菌木虱中,单虫检出率为96%.检测田间重、中等、轻病的柑桔园内的木虱,其带菌率依次为87%、53% 和21%.在病芦柑上饲菌不同天数的木虱均能检测出带菌,其饲菌时间最短为1d.城市九里香叶片及在其叶上取食的木虱单虫,均能用Nested PCR检测出病原.饲菌木虱接种九里香及芦柑健苗,在植株尚未表现症状时,常规PCR难检测出病原,但用Nested PCR则能检测到病原,说明九里香不仅是木虱的寄主,而且是黄龙病病原的隐症寄主. 2、应用多聚酶链式反应(PCR) 技术检测和定量分析柑桔黄龙病病原 3、柑桔黄龙病病原DNA 片段的克隆及序列分析 4、柑桔木虱(Diaphorina citri Kuwayama)与柑桔黄龙病流行关系的初 步研究 赵学源蒋元晖李世菱邱柱石苏维芳 【摘要】：1973-1978年用从田间病树上采集的柑桔木虱成虫放饲在398株健康柑桔苗上,有3 2株发病。用病树上采集的柑桔木虱高龄若虫置健苗上所羽化的成虫放饲的56株,有5株发病。未接虫的110株没有发病。初步说明柑桔木虱成虫可以传病。1973-1977年在广西境内的合浦、三江等27个县(市)调查柑桔木虱分布和柑桔黄龙病流行的关系。从总的趋势看,在北部未见木虱的地区,黄龙病不发生或不流行;在南部有木虱的大多数地区,黄龙病就会流行。北部未见木虱的桔林,从柳州重病苗圃引入的苗木,或用其接穗繁殖的苗木或高接的植株,均有发病,但未见蔓延。在南部有木虱分布的地区,有的果园多次喷洒杀虫剂,较好地防除了木虱,黄龙病很少发生。南部的梧州市红旗公社1965年从病区引进苗木,一部分种在地处缓坡丘陵柑桔木虱发生多的果园,1977年调查时大部植株已挖除,余下少数均为重病株。另一部分种在山冲,1977年调查时未见木虱,园中基本无缺株,查80株仅3株发病。上述情况说明黄龙病的流行与柑桔木虱的分布密切相关。因此严格防除柑桔木虱应列为预防黄龙病的一项重要措施。【作者单位】：中国农业科学院柑桔研究所中国农业科学院柑桔研究所中国农业科学院柑桔研究所广西壮族自治区农业科学院柑桔研究所广西柳州地区农科所 【关键词】：柑桔木虱柑桔黄龙病缓坡丘陵密切相关杀虫剂尤力克柠檬苗木植株 果园实生苗 【正文快照】：
柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析 孙大光;郑雪芳;刘波;阮传清;夏育陆;段永平 【摘要】Nested-PCR detection of Shunchang citrus Huanglongbing pathogen was carried out in this study. Phylogenetic tree based on rDNA sequencing was built to find out the evolutionary between different parts citrus HLB pathogens. Digesting the target DNA fragment of 16S rDNA with restriction enzyme Xbal was carried out to confirm the species of Shunchang Huanglongbing pathogen. The results showed that there were 7 positive detections in 12 selected samples, and the rate of positive detections was 58.33%, and four were dominant character, three were recessive character. The results showed that Shunchang citrus Huanglongbing pathogen belong to Candidatus Liberibacter asiaticus based on the 16S rDNA phylogenetic analysis and restriction enzyme Xbal digestion analysis. And 16S rDNA sequence gap analysis showed that the difference between Ca. L. Asiaticus and Ca. L. Africanus, Ca. L. Africanus and Ca. L. Americanus, Ca. L. Americanus and Ca. L. Asiaticus were 2.75%, 3.90%, 3.44%, respectively.%采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化
柑橘黄龙病的研究和防治 摘要：介绍柑橘黄龙病病原及其危害、主要发生区域。根据黄龙病发病机理控制其病害的传播，减少经济损失，促进柑橘业的发展。 关键词：柑橘黄龙病病原植物病理防控措施 柑橘黄龙病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一。20世纪初在我国的华南地区首先发现了黄龙病，以后在福建、广西、海南、江西、浙江、四川、云南、贵州、湖南和和台湾等地区相继发现。目前，柑橘黄龙病在印度次大陆、亚洲、东南亚、阿拉伯半岛和非洲等地方都有发生；2004年，巴西和美国的佛罗里达州也发生了黄龙病。黄龙病至今没有根治的方法，由于受各种条件的限制，其综合防治的效果并不理想，给柑橘生产造成严重损失，因此加强对黄龙病的研究很有必要。 1.柑橘黄龙病的病原研究 1919年Reinking报道我国华南地区发生了柑橘黄龙病后，在很长一段时间内，该病害的病因并没有得到确认。水害、镰刀菌、线虫、植株缺素等都曾经被认为是引起柑橘植株黄化的原因。1956年，林孔湘证实了兵书的单芽或枝条嫁接传播此病害，从而否认了水害、镰刀菌、线虫和缺素症等观点，并将该病害命名为柑橘黄龙病。之后曾有人认为该病害是由一种状病毒引起的。1979年，柯冲等在电镜下观察到了黄龙病原，菌体多数病原呈圆形或椭圆形，少数呈线粒或不规则形，大小为（50～600）nm×（170～1600）nm，其外围的单位膜是由3层膜构成，内、外的电子密度较浓，而中间的电子密度较薄，厚度为17～33nm，内部似有核糖蛋白体及似脱氧核糖核酸的构造。但是，由于无法通过人工培养，该病原曾被称为类病原体（MLO）、类立克次体（RLO）,后来又将其归于类细菌。柑橘黄龙病是由一种叫做韧皮部杆菌的病原引起的，已经确定的病原有亚洲、非洲和美洲3个种。病害通过种苗、嫁接和木虱介体等途径传播。病害可根据田间症状诊断，也可以通过血清学、电镜技术和PCR等分子生物学技术进行鉴定。目前，柑橘黄龙病主要依靠综合防治的方法。；开展病原的人工培养、抗病育种、致病机理和病害防治方法等方面的研究对揭示病原特性和病害防治都具有十分重要的意义。根据病原对热的反应、流行区域、虫媒种类等，以及单克隆抗血清反应、克隆的DNA片段的序列分析和DNA-DNA杂交反应等特征，将黄龙病病原分为亚洲和非洲两个种。2004年，巴西的圣保罗州发现了黄龙病，通过对症状、柑橘病叶和介体木虱等方面的研究，以及rDNA序列比较等，确定该病害主要由一个新的黄龙病病原引起，命名为黄龙病美洲种。 2.柑橘黄龙病的危害 柑橘黄龙病又叫黄梢病，它不仅使叶片转黄，果实发育不全，使柑橘产量降低、品质下降，病情严重时会使根系腐烂，影响地上植株的生长，甚至造成整片柑橘被毁，是柑橘管护中的重要防治对象。 2.1症状表现
柑橘黄龙病检测标准 柑橘是一种大家都爱吃的水果，尤其是近十几年来柑橘种植的规模一直在扩大，很多果农转业来到柑橘种植，这对柑橘市场也有一定的影响，许多新加入的果农不懂得如何去管理柑橘当柑橘出现，黄龙病时，会使他们措手不及，影响产量。黄龙病是高发的病害，它是由一种细菌引起的，那么我们如何防治柑橘黄龙病呢？下面跟着我来看一下。 在我国黄龙病经常会发生，尤其是南方，很多省市自治区深受黄龙病的影响，严重危害柑橘产量和柑橘的品质。那么柑橘黄龙病，在病发时有哪些症状呢？我给大家简单的描述一下，柑橘黄龙病，会在全年内发生，他发病的时间不确定，但是秋天和冬天，是黄龙病的高发期。当柑橘得了黄龙病时，会有一些典型的症状，比如叶片黄化，磺化后还带有小斑，还有均匀黄化等一些症状。叶片转绿以后会发生褪色，褪色的过程中会形成一些。 在形成这个黄斑的时候，他的位置整个斑，显示的形状都不确定，呈现一种雾状。首先发生在叶脉叶子的边缘等部分，当秋天气温回落。新出的叶子或者是已经变绿的叶子，它会逐渐变成黄色，逐渐均匀化。黄龙病的危害还可以引起柑橘的根部发生腐烂的症状，会造成根部细胞吸收。会造成整个植株发育不良，施肥吸水能力下降，叶片缺元素会引起叶片的一些典型发黄症状。黄龙病还有一种特别明显的症状就是，果实为青色，或者红红色青色果实在成熟的时期不会转为黄色，而会显示为青色特别像柚子。那么黄龙病到底是由什么引起的呢？根据显微镜下观察，黄龙病的病原物是一种阴性的细菌，对细菌呈现一种不规则状，会引起黄龙病的发生，十柑橘产量下降。黄龙病一般可以通过菟丝子、嫁接，还有就是叶片摩擦来引发病害，所以我们要及
时清理生病的果实、叶片和枝芽等减少传染源是病害发病率降低。 以上就是我为大家整理的黄龙病的症状，当柑橘黄龙病发生时，大家不要惊慌，一定要通过合理科学的规范操作来降低病害的发生，必要时寻求当地农业局的帮助，根据气候因地制宜的种植管理。同时也欢迎大家继续关注我们的xx站。
柑桔黄龙病研究进展与防控对策 柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing, HLB）是柑橘类植物的一种严重疾病，由革兰氏阴性细菌依卡氏假单胞菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）等引起的一种病害。该病害被认为是世界上最具破坏性的柑橘类病害之一，对柑橘果树的生长发育和产量造成了 巨大的影响，甚至会导致果树的死亡。目前，柑橘黄龙病在全球范围内造成了严重的危害，因此对其研究进展和防控对策的研究具有重要意义。 一、柑橘黄龙病的研究进展 1. 病原菌的鉴定 柑橘黄龙病的病原菌为革兰氏阴性细菌依卡氏假单胞菌，是一种传播速度极快，对柑 橘果树具有极大威胁的病原菌。通过分子生物学技术的研究，科学家们成功地鉴定出了引 起柑橘黄龙病的病原菌，并对其基因组结构和生物学特性进行了深入研究，为进一步研究 病原菌的生物学特性和生长繁殖机制提供了重要的基础。 2. 宿主植物的病理学研究 柑橘黄龙病的宿主范围极广，几乎包括所有的柑橘属植物，如柚、橙、柠檬等。科学 家们对柑橘黄龙病对不同柑橘类植物的病原性和危害程度进行了深入研究，揭示了不同柑 橘类植物对病害的感病性差异，为今后选择易感品种和研究抗病品种提供了理论依据。 3. 传播途径的研究 柑橘黄龙病主要通过黄龙虫传播，这是一种寄生在柑橘树上的病媒昆虫。科学家们对 黄龙虫的生态习性和传播途径进行了深入研究，揭示了黄龙虫在不同生长季节和不同气候 环境下的传播特点，为今后的防控工作提供了科学依据。 二、柑橘黄龙病的防控对策 1. 检疫管控 严格检疫出入境柑橘类植物和苗木，禁止黄龙虫携带的柑橘黄龙病的传播，有效地阻 断了柑橘黄龙病的传播途径，降低了疫情的风险。 2. 栽培管理 合理调整柑橘类果园的密度和结构，减少黄龙虫的栖息地，有效降低了柑橘黄龙病的 传播风险。 3. 生物防治
柑橘黄龙病病害循环 柑橘黄龙病特别难防治，最主要的原因就是柑橘黄龙病病害循环太厉害。树体感染上这种病害之后，三年之内，就不会再结果了。它主要通过木虱、嫁接这些方式来进行传播，而且蔓延得非常快。到了最后，整个柑橘园都被毁掉了。下面来介绍一下柑橘黄龙病的症状表现和防治方法。 症状表现。 柑橘黄龙病主要在柑橘树的枝叶，花果和根部位的症状比较明显。叶片会出现黄化，到了后期，新梢都抽不出来了。而且落叶非常严重，枝条也能慢慢枯死了。病部会变成玫瑰色，到最后植株也死亡了。果实上色出现问题，长得特别小，而且病根儿也都烂掉了。 那些老树、病树或者是受伤的树上，更容易感染上这种病害。而且它发病之后，蔓延得非常快。 防治方法。 1，管理要科学。 正是因为柑橘黄龙病病害循环太厉害，平时果农朋友们一定要把管理做到位了。做好管理，在一定程度上，也能够防止病害的发生。 对于已经发病的柑橘园，那些老树、病树、弱树，就别它他挂果了。本来这些树抵抗力就差，很容易感染病害的。要是再挂果，就更容易感染上病害了。 柑橘果实收获之后，落叶之前两个月，要上足了底肥。这样到第二年发芽的时候，能够给柑橘植株提供充足的营养，树体健壮了，它生病也少了。 不要上太多的化肥，也不要上太多的激素。尽量多上一些有机肥，多上一些生物菌，适当上一些微肥。
2，科学防治。 给柑橘树喷洒药物，尽量喷洒一些中药性质的，具有保护性质的药物，比如生物菌，沃丰素，中草药等等。 柑橘木虱是传播黄龙病的唯一的媒介，要做好木虱的防治工作。定期要在果园里喷洒大蒜油，它能够减少一些虫害。 用药方式多样化，可以灌根儿，可以刷干，也可以喷叶。 病枝病果病叶，要及时进行剪除，把它们带离柑橘园，集中处理掉。剪除部位是要涂抹一些中草药剂的，能够起到杀菌消毒的作用。 发生柑橘黄龙病，也都会发生根腐病。光把枝条剪掉，也解决不了问题，一般还会选择一些中草剂来进行灌根儿。 柑橘黄龙病特别难以防治，一旦发生，可以说就相当于病害里的癌症，根本就是治不好的。柑橘黄龙病病害循环太厉害，有可能做好了砍树工作，下一年它还会再发生。果农朋友们还是要做好防治工作，平时要做好管理。病害发生之后，尽量地喷洒一些中药性质的药剂。
柑橘黄龙病的防治技术研究最新进展柑橘黄龙病是一种严重威胁柑橘产业的病害，给全球柑橘栽培业造成了巨大的经济损失。为了有效控制和防治柑橘黄龙病，科学家们长期致力于研究，通过不断的探索和实践，取得了一系列的重要进展。本文将详细介绍柑橘黄龙病的防治技术研究的最新进展。 一、病原鉴定与诊断技术的突破 在柑橘黄龙病的防治中，准确鉴定与诊断病原是关键。科学家们通过不断改进病原鉴定与诊断技术，提高了检测的准确性和灵敏度。目前，利用PCR技术和基因测序技术可以快速检测和鉴定柑橘黄龙病的主要病原——黄龙病菌。这些技术的应用为病害的早期发现和防治提供了有力的技术支持。 二、种植结构调整与生态环境改善 随着对柑橘黄龙病的研究不断深入，人们逐渐认识到病害发生与种植结构以及生态环境密切相关。针对柑橘黄龙病的防治，科学家们提出了种植结构调整与生态环境改善的策略。通过合理调整种植结构，选择抗黄龙病品种进行栽培，减少柑橘黄龙病的发生。同时，优化柑橘园的生态环境，改善土壤条件，增加益生菌的施用，提高柑橘树抵抗病害的能力。这些措施的实施为柑橘黄龙病的防治提供了重要的参考。 三、化学控制技术的进步
除了生态环境调整，化学控制技术仍然是柑橘黄龙病防治的重要手 段之一。近年来，科学家们不断改进化学农药的配方和使用方法，提 高了化学控制技术的效果。特别值得一提的是，新型化学农药的研发 取得了一系列的突破，这些新型农药在效果上更加显著，并且对环境 友好。研究人员还研发了一种基于遗传工程的农药喷洒系统，能够有 针对性地清除柑橘黄龙病的病原。这些新技术的应用，为柑橘黄龙病 的化学防治提供了新的思路和方法。 四、生物防治技术的创新应用 近年来，生物防治技术逐渐成为柑橘黄龙病的重要防控手段。比如，利用益生菌和拮抗细菌来调节土壤微生物群落的组成，增加有益菌的 数量，减少病原菌的生长和传播。此外，还有研究表明，某些寄生性 线虫对柑橘黄龙病的防治也具有一定效果。这些生物防治技术的创新 应用，在理论研究和实践探索中都取得了显著的成果。 五、综合防治策略的制定与实施 针对柑橘黄龙病的复杂性和难治性，科学家们提出了综合防治策略 的制定与实施。综合防治策略是基于深入研究病害发生机制和防治技 术的基础上，通过有效整合多种防治手段，形成一套科学合理的防治 方案。综合防治策略不仅包括病原鉴定与诊断、种植结构调整与生态 环境改善、化学控制技术和生物防治技术的综合应用，还包括对柑橘 黄龙病发生规律的研究，及时处理柑橘黄龙病病株，加强病害监测等 方面的工作。综合防治策略的制定与实施，为柑橘黄龙病的防治提供 了全面的技术支持。
一、实验目的 1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法； 2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。 二、实验原理 细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。 16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下： 细菌基因组的提取： PCR 的基本原理 ： PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；
柑橘黄龙病PCR检测方法有付出有风险才有收获的，而且种植柑橘是不可能一帆风顺的，柑橘和人一样也会生病，有叶片的，有树干的，有果实的。这篇文章让我们来了解一下柑橘的黄龙病，那什么是柑橘黄龙病呢？柑橘黄龙病的PCR检测方法是什么呢？我们又应该如何预防柑橘黄龙病呢？ 1，柑橘黄龙病 和人生病一样，柑橘的黄龙病也有一个进程。柑橘得了黄龙病后，首先柑橘的叶片会发黄、变的脆、硬容易一掐就掉，叶片的脉络也会发肿，柑橘叶片的表面不再整齐不再有光泽，因此，早期我们可以通过观察柑橘叶片来大致判定柑橘是否病变。其次是柑橘的树尖，柑橘的树尖会出现一个黄化现象，出现很多营养不良的树枝，该树枝会发黄，但发黄底下的树叶又是正常的！再次，是柑橘的花，得病的柑橘树容易提前开花，但花比正常的花更加容易凋落。最后是柑橘树根的一个症状，树根会腐败坏死。柑橘黄龙病的发病是从上往下的，不会直接从根系坏死，所以，平常我们就可以通过观察柑橘树的一个基本情况来防御治疗。 2，柑橘黄龙病PCR检测方法 因为，显微镜检查对柑橘的黄龙病容易出现一个漏检，血清学方法范围又会相当于比较狭窄，所以，我们通常用PCR去检测柑橘是否患有黄龙病。PCR中文名是聚合酶链式反应，即通过一些仪器设备去检测柑橘体内病原体的DNA序列看是否和黄龙病的DNA序列一致，因此来判定柑橘是否患有黄龙病。 3，柑橘黄龙病的预防 （1）加强柑橘苗的检查，严禁得病的种子和苗流入市场，防止刚开始种植柑橘而不了解此种疾病的人误选误种！
（2）一旦发现有黄龙病的发生，马上处理！柑橘感染黄龙病后只会越来越严重，还有可能传染给其他健康树苗，所以，当发病后，应当把得病的果树连根挖起，将病枝病叶用火烧毁。 （3）柑橘木虱是传染黄龙病的媒介，因此我们应尽量消除柑橘木虱，切除因得了黄龙病而发黄的树枝树叶，饿死木虱。 以上是关于柑橘黄龙病的一些相关知识，种植柑橘的农户也不要怕这个黄龙病，只要预防治疗得当，它根本不值一提。也希望以后大家能略微了解下柑橘黄龙病PCR检测方法，方便以后的管理。
细菌16srdna序列 细菌16S rDNA序列是一种重要的遗传物质，它在细菌分类学和进化研究中扮演着重要的角色。本文将从细菌16S rDNA序列的意义、应用以及分析方法等方面进行阐述。 一、细菌16S rDNA序列的意义 细菌16S rDNA序列是细菌基因组中的一个高度保守的区域，它在细菌中普遍存在，具有高度的保守性和多样性。因此，通过分析细菌16S rDNA序列，可以揭示细菌的亲缘关系和分类地位。细菌16S rDNA序列的分析可以帮助我们了解细菌的进化关系、物种多样性以及细菌在环境中的分布情况。 二、细菌16S rDNA序列的应用 1. 细菌分类和鉴定：通过比对已知的细菌16S rDNA序列数据库，可以确定未知细菌的分类地位和鉴定其物种。这对于细菌的分类学研究以及临床微生物学和环境微生物学等领域具有重要意义。 2. 细菌进化研究：通过比较不同细菌的16S rDNA序列，可以推断它们之间的进化关系和亲缘关系，进而了解细菌的进化历史和演化过程。 3. 环境微生物学研究：通过分析环境样品中的细菌16S rDNA序列，可以了解细菌在不同环境中的分布情况，揭示细菌在自然界中的功
能和作用。 三、细菌16S rDNA序列分析方法 1. PCR扩增：首先需要从细菌中提取出基因组DNA，然后使用引物对16S rDNA序列进行PCR扩增。PCR扩增是将16S rDNA序列扩增成大量的DNA片段，为后续的测序提供足够的模板。 2. 测序：将PCR扩增产物进行测序，可以使用Sanger测序或高通量测序技术。测序得到的数据就是细菌16S rDNA序列的碱基信息。 3. 数据分析：将测序得到的数据与已知的16S rDNA序列数据库进行比对，使用比对软件进行序列比对和物种鉴定。常用的比对软件有BLAST和MEGA等。 4. 构建系统发育树：根据比对结果，可以使用系统发育学的方法，如最大似然法或邻接法，构建细菌的系统发育树，揭示细菌之间的亲缘关系和进化关系。 四、细菌16S rDNA序列的挑战和前景 细菌16S rDNA序列的分析虽然在细菌分类学和进化研究中具有重要意义，但也面临一些挑战。例如，由于16S rDNA序列的高度保守性，有时难以区分近缘物种或亚种。此外，16S rDNA序列的长度有限，不能提供足够的信息来解决一些复杂的分类和进化问题。
柑橘黄龙病成灾原因及防控措施研究 作者：马振平 来源：《农家科技下旬刊》2015年第01期 摘要：柑橘黄龙病是造成柑橘产区毁灭性损害的一种严重病害，国外及国内都将黄龙病作为重点防治的植物疫病。上世纪90年代，我国柑橘黄龙病疫情开始出现，并出现快速蔓延之势，被感染的产区柑橘产量大大减少，严重的失去商品价值且柑橘树会出现枯死现象，甚至完全丧失结果能力，因此，柑橘黄龙病的防治具有重要意义。为此，本文以柑橘黄龙病为研究对象，分析了柑橘黄龙病成灾的原因及防控措施，旨在提升柑橘黄龙病的防控水平。 关键词：柑橘黄龙病；植物检疫；防控措施；苗木引种 多年来，我国南方多省的柑橘产区都被柑橘黄龙病侵扰，甚至引起了当地柑橘产业的衰落。近年来，柑橘黄龙病又出现复发之势，鉴于该病害对柑橘产业造成严重的威胁，要积极探索柑橘黄龙病的成灾原因，了解柑橘黄龙病的鉴别特点，并积极如何在柑橘种植生产中避免黄龙病发生，以保障柑橘产业获得良好的经济收益。 一、柑橘黄龙病成灾原因分析 1.健康苗木供应不足，乱引乱调现象普遍 近年来，随着柑橘价格的回落，我国柑橘产业出现快速发展之势，对柑橘苗木的需求急剧增加，从而在苗木采购方面，乱引乱调现象普遍，健康无病苗木供不应求。引发上述问题的主要原因是种苗监管存在局限性。同时，由于通过检疫的健康无病苗木供不应求，所以柑橘产区之间购买自育种苗的活动更加频繁，渐渐形成了乱引乱调之势。部分柑橘产区曾出现刚定植的果园，就出现大面积黄树的现象，黄树率甚至超过10%，从而充分说明苗木供应本身存在重要问题。 2.粗放式管理，难以建立有效的防治机制 近年来，我国南方柑橘产区受自然灾害的影响较大，柑橘减产问题严重，运输问题难以解决，加之果品价格低迷，橘农认为无法达到预期收益，索性弃置管理或粗放管理果园。在粗放甚至弃管情况下，未进行梢期大面积统一防治，导致黄龙病开始自由蔓延。很多小型果园，更缺乏联防联控的意识，难以建立有效的防治机制，导致黄龙病的防治变得分散，难以全面消灭病源和虫源。 3.科学研究相对滞后，防治技术未落实到实际
江西省大余县柑橘黄龙病菌PCR检测 刘登全;涂怀妹;李霖;蒋军喜 【摘要】采用PCR扩增和核苷酸序列测定技术,对分别采自江西省大余县青龙镇郭屋坝果园和丰顺果园的各5份疑似柑橘黄龙病样品进行病原检测。结果表明：2个青龙郭屋坝果园样品中检测到柑橘黄龙病菌,分别命名为DY-LAS01和DY-LAS02,其他8份样品中则未检测到该病菌。此结果表明大余县已有柑橘黄龙病发生,希望引起当地有关部门的高度重视。%Pathogenic detection of ten suspected citrus huanglongbing (HLB) leaf samples from Qinglongguowuba orchard and Fengshun orchard in Dayu County of Jiangxi Province was performed using PCR and nucleotide sequencing technology. Candidatus Liberibacter asiaticus was detected from two samples of Qinglongguowuba orchard, and they were given the name of DY-LAS01 and DY-LAS02, respectively, while Ca. Liberibacter asiaticus was not detected from the other eight samples. The results showed that HLB has occurred in Dayu County, which should be paid attention by the local government. 【期刊名称】《生物灾害科学》 【年(卷),期】2012(000)003 【总页数】3页(P261-263) 【关键词】柑橘黄龙病菌;病原检测;多聚酶链式反应;序列测定 【作者】刘登全;涂怀妹;李霖;蒋军喜
菌种鉴定的分子生物学方法 ——16S rDNA 测序鉴定菌种 一． 原理 细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。 二． 技术路线 该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下： 三． 方法步骤 （一）细菌基因组DNA 提取（酶解法） 1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。 细菌培养液 基因组DNA DNA 提取 PCR 扩增 16S rDNA 片段 片段回收 连接克隆载体 阳性克隆鉴定 测序
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA 的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA 全长序列分成3部分进行测序。
16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感 染病原菌比较 金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠 【摘要】目的比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析在血流感染病 原菌检测中的作用.方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组DNA,运用16S rRNA、16S-23S rRNA基因进行PCR扩增.扩增产 物经测序后在美国国家生物技术中心( NCBI)上进行比对分析,确定菌种.结果在所 分析的19种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属；16S-23SrRNA成功鉴定17 种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平.结论 16S-23S rRNA基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标. 【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》 【年(卷),期】2012(004)003 【总页数】5页(P181-185) 【关键词】16SrRNA;16S-23SrRNA 【作者】金中淦;葛平;徐蓉;陈蓉;宣瑛;刘学杰;王庆忠
【作者单位】上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上 海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126; 上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床检验中心,上海,200126;上海市临床 检验中心,上海,200126 【正文语种】中文 以菌血症和败血症为主的血流感染具有低发生率、高危险性的特点[1]。据报道， 美国血流感染的总体病死率可高达14%～63%，但在明确病原菌后采用针对性治疗，其死亡率可降至5%～17%[2～4]。因此及时快速诊断病原菌对合理用药、缩短疗程等具有重要意义。目前临床上血流感染检测主要采用血培养结合病原菌生化鉴定和药敏试验，以细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等表型特征对细菌进行分类鉴定，但这种诊断规程存在周期长、阳性率低等诸多不足。近年来，分子生物学和基因诊断技术的不断发展为血流感染的检测提供了新的思路。病原菌的基因组较生化指标稳定，通过基因扩增及其后续技术可以快速、准确地检测病原菌。本研究主要针对16S rRNA基因、16-23S rRNA间隔区基因进行PCR扩增，扩增产物经测序分析后在美国国家生物技术中心（NCBI）上进行比对分析，确定菌种，并比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析在血流感染病原菌鉴定中的作用。 1.1 实验菌株 实验用病原细菌由上海市临床检验中心微生物室提供，分别为冻干标准菌株金黄色葡萄菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，ATCC12228）、大肠埃希菌（Escherichia coli，ATCC25922）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis，ATCC29212）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，ATCC49619）、铜绿假单胞菌
一、实验原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR 扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。 16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下： PCR实验原理
即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 二、主要器具及试剂 PCR、电泳系统、DNA提取体系、Taq Polymerase、DNA Marker，溶菌酶、dNTP和E.coli JM109感受态细胞、pMD18-T Vector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH 8.0） 三、操作方法 1. 细菌基因组总DNA的提取 接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180 r/min，37 ℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。 (1)菌体收集：取1.5 mL新鲜的菌液于EP管中，12000 r/min离心30 s，弃净上清，收集菌体。 (2)辅助裂解：加100 μg/mL溶菌酶50 μL，37 ℃处理30min。 (3)裂解：向每管加入200 mL预冷的SDS裂解缓冲液，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。 (4)向每管加入66 μL 5 mol/L NaCl，充分混匀后，12000 r/min离心10 min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。 (5)将上清转移到新EP管中，加入等体积的Tris-饱和酚，充分混匀，12000 r/min离心3 min，进一步沉淀蛋白质。 (6)取离心后的水层，加等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），充分混匀后，12000 r/min离心3 min，去除苯酚。 (7)小心取上清，用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，13000 r/min离心15 min，弃上清。 (8)用400 μL75%的乙醇洗涤沉淀2次。 (9)室温干燥后，用40 μL 1×TE溶解DNA。 (10)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。 (11)提取的基因组总DNA-40 ℃冰箱保存备用。