柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性
孙大光1,2，郑雪芳2，刘波2 ，阮传清2，范国成2，夏育陆3，Hall D.4，段永平4
（1福建师范大学生命科学学院，福州350108；2福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心，福州350003；3美国北卡州立大学有害生物综合治理研究中心, 美国；4美国农业部佛罗里达园艺试验室，弗罗里达34945）
摘要：对红心柚、蜜桔、金桔内生细菌进行分离鉴定并做多样性分析，为研究柑橘内生细菌与柑橘病害的生物防治奠定基础。平板分离法分离柑橘不同器官内生细菌，采用美国MIDI微生物鉴定系统鉴定菌株，对内生细菌数量进行统计、分类，并作群落多样性分析。3种柑橘共分离得到的内生细菌属于32个种，隶属于17个属。红心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌10个属13个种，14个属22个种，12个属21个种。不同种类细菌中芽孢杆菌属细菌含量最高，3种柑橘中金桔的内生细菌含量最高，不同器官中根部的内生细菌含量最高。柑橘内生细菌进行聚类分析表明，。。。。。。。。。。。。。。。。。。。在不同柑橘和不同器官中内生细菌的种类、数量和群落多样性存在较大差异。蜜桔叶片内生细菌的SIMPSON（D）指数最高；蜜桔叶片内生细菌的SHANNON（H1）指数最高；蜜桔根部内生细菌Pielou指数最高。本研究丰富了柑橘内生细菌资源，为柑橘内生细菌的利用提供了物质基础，并对科学说明生防作用机理具有重要价值。
关键词：柑橘内生细菌PLFA多样性分布
S eparation, identification and distribution of endophytic bacteria in citrus
SUN Da-guang1，2，ZHENG Xue-fang2，LIU Bo2*,
RUAN Chuan-qing2, FAN Guo-cheng2, XIA Yu-lu3, Hall D.4, DUAN Yong-ping4
1. College Of Life Science Fujian normal university, Fuzhou 350108, China;
2.Citrus Huanglongbing Research Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China；
3. The Center of Integrated Pest Management, North Carolina State University, North Carolina, USA；
4. Horticultural Research Laboratory (USDA/ARS), Florida, 34945, U.S.A
Abstract: In order to ascertain the connection between citrus endopphytic bacteria and the Biological control about citrus Disease, the study on the citrus endophyte’s number, bacteria’s identification and community multiplicity analysis were conducted. The endophytic bacteria were isolated using the culture method and identified by Microorganism Identification System (MIDI system produced by USA). 32 microbial species identified belonging to 17 genera of bacteria were detected from endophytic bacteria in Citrus grandis Osbeckcv, Chinese honey orange and Cumquat. The content of Bacillus was the most in all endophyte, Cumquat’s endophyte was the most among 3 these citrus and the number of endophytic bacteria in root was more than other organs. The cluster analysis results showed that 32 strains could be separated into 7 groups. The community multiplicity and diversity of endophytic bacteria were significant different in 3 different citrus.
Keyword：citrus；endophytic bacteria；PLFA；community multiplicity
柑橘是世界第一大果树品种，全球有135个国家和地区生产柑橘，2008年我国成为世界柑橘第一大国[1, 2]。柑橘不仅仅口味宜人而且本身具有很多功能性物质，可广泛应用于功能性食品的开发、药物的开采及一些功能性饲料的研制等[3]。
内生细菌（endophytic bacteria）是指从经过表面消毒植物组织分离得到并不会对植物本身造成实质性伤害，而且在一定的程度上还会与植物建立和谐关系的细菌[4, 5]。其对植物的作用表现在很多方面，如有些内生细菌可以产生植物激素促进植物生长[6]，有些促进植物生物固氮作用[7]，有些可以产生抗生素增加植物对抗病原菌和外来寄生虫的抵抗能力[8]。了解内生细菌与植物生长之间的关系，并且能够将这些关系应用到农业生产、保护生物多样性以及保持农业生态平衡具有重要的意义[9]。
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项(No.201003067-05)；中美合作项目-柑橘木虱及黄龙病野外研究(No.2010-1652-02)、抗虫柑橘品种研究（No.6618-22000-037-01S）；福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（No.STIF-Y03）
作者简介：孙大光（1987—），男，硕士研究生.，主要从事植物内生菌的研究，E-mail：woshisdg@https://www.doczj.com/doc/1a19308191.html,
*通讯作者（责任作者）：刘波（1957—），男，博士，研究员，从事微生物生物技术与农业生物药物研究，E-mail：liubofaas@https://www.doczj.com/doc/1a19308191.html,
自1866年De Bary将生活在植物组织内的微生物与植物表面的微生物相区别以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛关注[10]。据不完全文献统计，目前已从甜菜[11]、牧草[12]、小麦[13]、水稻[14]、马铃薯[15]等近30种植物中分离了近60个属的内生细菌[16]。罗永兰等从柑橘植株中分离得到多种内生细菌[17]。张翼等从柑橘枝条中分离得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )YS45菌株对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)具有拮抗作用[18]。Araújo等[19]从甜橙中分离得到短小杆菌（Curtobacteria flaccumfaciens）可以抑制柑橘杂色褪绿病(Citrus Variegated Chlorosis,CVC)菌(Xyllela fastidiosa)的生长。
目前对柑橘内生细菌的研究主要集中在内生菌的分离、鉴定、生物防治、促生因子、抑菌活性物质分析等方面[17, 20]，而国内外对柑橘内生细菌群落结构的研究比较少见。本研究采用美国MIDI微生物鉴定系统对不同品种柑橘植株分离的内生细菌进行鉴定，了解内生细菌在柑橘植株不同品种和不同部位的分布特性，为柑橘内生细菌相互关系的研究和内生细菌资源开发利用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
供试的柑橘植株为2010年7月23日在顺昌北门水库边赵氏园艺技术研究所果树基地采集的3个柑橘品种，分别为红心柚（Citrus grandis Osbeck cv.Chander），蜜桔（Citrus unshiu Marc）和金桔（Fortunella margarita （Lour.）Swingle）。采集方法，选择一株具有典型黄龙病病症的红心柚（Citrus grandis Osbeck.Chandler），分别从植株东面、南面、西面、北面取其上部、中部、下部共12个部位叶片、枝条及其根部。将供试材料立即带回实验室并进行处理。
NA培养基、TSB培养基、脂肪酸提取处理试剂、气相色谱系统、分析软件、均参考蓝江林等[21]的方法。试剂：甲醇，正已烷甲基叔丁基乙醚（fisher公司），盐酸，氢氧化钠（优级纯），脂肪酸混合标样（C9至
C20），去离子水。
1.2方法
1.2.1柑橘内生细菌的分离与数量统计
分别称取叶片5g，首先将叶片用自来水冲洗干净，吸干叶片表面的水，在75%酒精里浸泡30s，接着用10%次氯酸钠浸泡5分钟，再用无菌水漂洗叶片3次。为了检验表面灭菌的效果，用灭过菌的镊子夹着叶片是叶片表面与NA平板接触2min然后放在30℃培养2d，若发现平板上没有菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，改样品得到的结果可信，否则该分离结果不能使用。
无菌操作将叶片剪碎至于研钵里并加入45mL无菌水，充分研磨匀浆制成10-1样品原液，静置30min。依次将原液稀释至10-2，10-3，取200µL加到NA平板上，涂布至平板干燥，试验重复3次。将涂布后的NA 平板至于28℃的培养箱培养24h，观察菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征。.挑取各部位具有代表性的单菌落，并计数、纯化、20%甘油-80℃保存分离得到的菌株。
根据内生细菌菌落形态结构等特征，对不同柑橘植株和不同器官中内生细菌出现的数量进行统计。内生细菌含菌量（cfu·g-1FW）即每克柑橘鲜重组织经培养后产生的菌落个数。
1.2.2细菌种类鉴定（脂肪酸鉴定法）
细菌鉴定通过美国MIDI公司开发的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS鉴定，脂肪酸提取，脂肪酸的检测参考蓝江林等方法[21]。
1.2.3柑橘内生细菌的聚类分析
参考车建美等[22]方法，以分离到的内生菌菌株为样本，以各菌株在不同柑橘器官中的含量指标，组成数据矩阵，将所得数据输入DPS 7.05数据处理系统，采用马氏距离为聚类尺度，以类平均法对数据进行系统聚类分析，并自动生成各供试菌株的聚类图和相异系数表。
1.2.3柑橘内生细菌的群落多样性指数
柑橘各器官（叶、茎、根）内生细菌种群多样性指数分析，将不同器官内生细菌含量作为数量测度，引入生态学多样性测度SIMPSON（D）指数、SHANNON（H1）指数、Pielou 指数等方法。SIMPSON（D）计算公式为：D=1-∑Pi，式中Pi种内生细菌占该试验中总的内生细菌的个数比例。SHANNON（H1）计算公
式为：H1=-∑PilnPi ，式中Pi=Ni/N，Ni为处理i的内生细菌个数，N为该试验中总内生细菌个数。S为某类细菌i在供测样品中出现的次数。Pielou指数（J）计算公式为：J=-∑PilnPi/lnS ，式中S为群落中的内生细菌的总种类数。
2结果和分析
2.1柑橘内生细菌分离与鉴定
按照菌落形态差异，从红心柚根、枝条、叶分别分离得到5、27、37株内生细菌；蜜桔根、枝条、叶分离得到7、18、32株内生细菌；金桔根、枝条、叶分离得到5、21、32株内生细菌，共184株。
利用微生物鉴定仪（MIDI）鉴定结果表明，其中相似系数大于0.500的菌株有139株，这些菌株属于32个种，隶属于17个属（表2），分别是Bacillus（芽孢杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、Brevibacillus （短芽孢杆菌属）、Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）、Acinetobacter（不动杆菌属）、Microbacteria（微杆菌属）、Curtobacteria（短小杆菌属）、Brevundimonas（短波单胞菌属）、Pseudomonas（假单胞菌属）、Methylobacteria （甲基杆菌属）、Pectobacteria（果胶杆菌属）、Arthrobacter（节细菌属）、Sphingobium（鞘脂菌属）、Stenotrophomonas （寡养单胞菌属）、Cedecea（西地西菌属）、Delftia（代尔夫特菌属）、Zoogloea（动胶菌属）。其中芽孢杆菌属包含有6个种，Staphylococcus（葡萄球菌属）、Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）、Acinetobacter（不动杆菌属）和Methylobacteria（甲基杆菌属）各包含有3个种，Brevibacillus（短芽孢杆菌属）和Arthrobacter（节细菌属）各包含有2个种，其余的10个属各包含1个种。
表2柑橘内生细菌鉴定结果
Table 2 The identification of endophytic bacteria from citrus
菌株编号Number of strains
属
Genus name
种名
Species name
中文名称
Chinese name
相似系数
Similarity name
FJAT-10615 Bacillus（芽孢杆菌属）Bacillus cereus 蜡样芽胞杆菌0.744 FJAT-10632 Bacillus（芽孢杆菌属）Bacillus megaterium 巨大芽孢杆菌0.813 FJAT-10433 Bacillus（芽孢杆菌属）Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌0.692 FJAT-11012 Bacillus（芽孢杆菌属）Bacillus viscosus 稠性杆菌0.778 FJAT-10619 Bacillus（芽孢杆菌属）Bacillus pumilus 短小芽孢杆菌0.699 FJAT-10800 Bacillus（芽孢杆菌属）Bacillus thuringiensis 苏云金芽孢杆菌0.675 FJAT-10161 Staphylococcus（葡萄球菌属）Staphylococcus hominis 人葡萄球菌0.835 FJAT-11086 Staphylococcus（葡萄球菌属）Staphylococcus cohniicohnii 科氏科葡萄球菌0.695 FJAT-10417 Staphylococcus（葡萄球菌属）Staphylococcus arlettae 阿尔莱特葡萄球菌0.5 FJAT-10623 Brevibacillus（短芽孢杆菌属）Brevibacillus parabrevis 副短短芽孢杆菌0.657 FJAT-10620 Brevibacillus（短芽孢杆菌属）Brevibacillus choshinensis 桥石短芽孢杆菌0.737 FJAT-10617 Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）Sphingomonas capsulata 暂无0.852 FJAT-10625 Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）Sphingomonas paucimobilis 少动鞘氨醇单胞菌0.709 FJAT-11010 Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）Sphingomonas sanguinis 血红鞘氨醇单胞菌0.795 FJAT-10162 Acinetobacter（不动杆菌属）Acinetobacter baumannii 鲍氏不动杆菌0.546 FJAT-11022 Acinetobacter（不动杆菌属）Acinetobacter genomospecies 暂无0.753 FJAT-11007 Acinetobacter（不动杆菌属）Acinetobacter calcoaceticus 醋酸钙不动杆菌0.622 FJAT-10421 Microbacteria（微杆菌属）Microbacteria chocolatum 暂无0.64 FJAT-11094 Curtobacteria（短小杆菌属）Curtobacteria flaccumfaciens 萎蔫短小杆菌0.813 FJAT-10635 Brevundimonas（短波单胞菌属）Brevundimonas vesicularis 泡囊短波单胞菌0.836 FJAT-10818 Pseudomonas（假单胞菌属）Pseudomonas putida 恶臭假单胞菌0.691 FJAT-10634 Methylobacteria（甲基杆菌属）Methylobacteria organophilum 嗜有机甲基杆菌0.884 FJAT-10427 Methylobacteria（甲基杆菌属）Methylobacteria rhodesianum 暂无0.874 FJAT-10425 Methylobacteria（甲基杆菌属）Methylobacteria mesophilicum 嗜中温甲基杆菌0.918 FJAT-11084 Pectobacteria（果胶杆菌属）Pectobacteria carotovorum 暂无0.781
FJAT-10618 Arthrobacter （节细菌属） Arthrobacter aurescens 金黄节杆菌
0.745 FJAT-11091 Arthrobacter （节细菌属） Arthrobacter histidinolovorans 暂无 0.912 FJAT-10629 Sphingobium （鞘脂菌属） Sphingobium yanoikuyae 暂无 0.795 FJAT-10420 Stenotrophomonas （ 寡养单胞菌属）
Stenotrophomonas maltophilia
嗜麦芽寡养单胞菌 0.783 FJAT-11013 Cedecea （西地西菌属） Cedecea davisae 戴氏西地西菌 0.693 FJAT-10430 Delftia （代尔夫特菌属） Delftia acidovorans 食酸代尔夫特菌 0.82 FJAT-10636
Zoogloea （动胶菌属）
Zoogloea ramigera
枝状动胶菌
0.572
2.2内生细菌在柑橘品种间的分布
（1）内生细菌在柑橘品种间的数量分布
不同柑橘内生细菌含量有差别（见图1）。金桔内生细菌含量最高达到2.6953×105 CFU·g -1，其次是红心柚内生细菌含量，达8.821×104 CFU·g -1，蜜桔内生细菌含量最低，为7.177×104 CFU·g -1。
51015202530
内生细菌含量×104 C F U •g -1
图1不同柑橘内生细菌含量图
Fig 1 The content and distribution of endophytic bacteria isolated from citrus
（2）内生细菌在柑橘品种间的种类分布
不同内生细菌在3种柑橘中含量有很大差异（图2），其中芽孢杆菌属内生细菌为优势菌株，其含量在3种柑橘中的含量均为最高，芽孢杆菌在红心柚、蜜桔和金桔中的百分含量分别为30.88%、23.76%和30.00%。而在3种柑橘中都存在的内生细菌Bacillus （芽孢杆菌属）、Brevibacillus （短芽孢杆菌属）、Sphingomonas （鞘脂单胞菌属）、Acinetobacter （不动杆菌属）、Curtobacteria （短小杆菌属）、Arthrobacter （节细菌属）。
红心柚中不同内生细菌含量从高到低依次Bacillus （27.25×103CFU•g -1）、Staphylococcus （10.82×103CFU•g -1）、Curtobacterium （10.32×103CFU•g -1）、Pseudomonas （9.62×103CFU•g -1）、Stenotrophomonas （9.41×103CFU•g -1）、Brevibacillus （6.49×103CFU•g -1）、Arthrobacter （6.47×103CFU•g -1）、Sphingomonas （3.64×103CFU•g -1）、Pectobacteria （2.49×103CFU•g -1）、Acinetobacter （2.45×103CFU•g -1）。
-5
0510********内生细菌含量（×103 C F U •g -1）
图2内生细菌在不同柑橘中含量分布图 Fig 2 The content of endophytic bacteria in different citrus
注：1-17表示Bacillus 、Staphylococcus 、Brevibacillus 、Sphingomonas 、Acinetobacter 、Microbacteria 、Curtobacteria 、Brevundimonas 、Pseudomonas 、Methylobacteria 、Pectobacteria 、Arthrobacter 、Sphingobium 、Stenotrophomonas 、Cedecea 、 Delftia 、Zoogloea
蜜桔中不同内生细菌含量从高到低依次是Bacillus （17.05×103CFU•g -1）、Methylobacteria （10.54×103CFU•g -1）、Sphingomonas （8.52×103CFU•g -1）、Pectobacteria （4.78×103CFU•g -1）、Acinetobacter （4.67×103CFU•g -1）、Arthrobacter （4.35×103CFU•g -1）、Microbacteria （3.96×103CFU•g -1）、Delftia （3.43×103CFU•g -1）、Brevibacillus （3.27×103CFU•g -1）、Stenotrophomonas （3.21×103CFU•g -1）、Curtobacteria （2.76×103CFU•g -1）、Sphingobium （2.19×103CFU•g -1）、Brevundimonas （1.92×103CFU•g -1）、Staphylococcus （1.26×103CFU•g -1）。
-2
2468
101214161820
内生细菌含量（×103 C F U •g -1）
图2内生细菌在不同柑橘中含量分布图 Fig 2 The content of endophytic bacteria in different citrus
注：1-17表示Bacillus 、Staphylococcus 、Brevibacillus 、Sphingomonas 、Acinetobacter 、Microbacteria 、Curtobacteria 、Brevundimonas 、Pseudomonas 、Methylobacteria 、Pectobacteria 、Arthrobacter 、Sphingobium 、Stenotrophomonas 、Cedecea 、Delftia 、Zoogloea
在金桔中不同内生细菌含量从高到低依次是Bacillus （80.86×103CFU•g -1）、Brevibacillus （46.95×
103CFU•g -1）、Acinetobacter （26.95×103CFU•g -1）、Pseudomonas （23.48×103CFU•g -1）、Curtobacteria （18.48×103CFU•g -1）、Sphingomonas （15.84×103CFU•g -1）、Sphingobium （14.48×103CFU•g -1）、Brevundimonas （11.48×103CFU•g -1）、Methylobacteria （9.48×103CFU•g -1）、Cedecea （9.48×103CFU•g -1）、Arthrobacter （8.48×103CFU•g -1）、Zoogloea （3.48×103CFU•g -1）。
-10
0102030405060708090内生细菌含量（×103C F U •g -1）
图2内生细菌在不同柑橘中含量分布图 Fig 2 The content of endophytic bacteria in different citrus
注：1-17表示Bacillus 、Staphylococcus 、Brevibacillus 、Sphingomonas 、Acinetobacter 、Microbacteria 、Curtobacteria 、Brevundimonas 、Pseudomonas 、Methylobacteria 、Pectobacteria 、Arthrobacter 、Sphingobium 、Stenotrophomonas 、Cedecea 、 Delftia 、Zoogloea
2.3内生细菌在柑橘器官中的分布
（1）内生细菌在柑橘器官中的数量分布
柑橘不同器官内生细菌含量有差异，结果见图。红心柚叶片、枝条和根部内生细菌含菌量规律为根部>枝条=叶片。蜜桔叶片、枝条和根部内生细菌含菌量规律为根部>叶片>枝条。金桔叶片、枝条和根部内生细菌含菌量规律为根部>枝条>叶片。
-5
0510152025
内生细菌含量×104 C F U •g -1
叶片Leaf
图1不同柑橘内生细菌含量图
Fig 1 The content and distribution of endophytic bacteria isolated from citrus
（2）内生细菌在柑橘器官中的种类分布
图3所示，在红心柚根部、枝条和叶片分别分离得到内生细菌2个属3个种，4个属5个种，6个属9个种。蜜桔根部、枝条和叶片分别分离得到内生细菌2个属5个种,6个属7个种,11个属16个种。金桔根部、枝条和叶片分别分离得到内生细菌2个属4个种,6个属10个种,11个属18个种。从柑橘植株的下部器官到上部器官，内生细菌的种类是呈现上升趋势的，且叶片和枝条内生细菌种类个数均为金桔>蜜桔>红心
柚,而在根部种类个数则是蜜桔>金桔>红心柚。
2468101214161820根枝条叶片
内生细菌种类（种）
红心柚蜜桔金桔
图3柑橘不同器官内生细菌种类含量图 Fig 3 The category and content of endophytic bacteria in citrus
2.3 柑橘内生细菌聚类分析
柑橘内生细菌在不同品种柑橘中的分布情况统计结果见图4。
根据不同部位内生细菌的数量关系采用马氏距离，类平均法做出的聚类分析看不出什么规律。
表3柑橘内生细菌的种类和分布
Table 3 The distribution of endophyte bacteria isolated from different citrus 编号 Number
红心柚
Citrus grandis Osbeckcv
蜜桔
Chinese honey orange
金桔 Cumquat 根 Root
枝 Branch 叶 Leaf
根 Root
枝 Branch
叶 Leaf
根 Root 枝 Branch
叶 Leaf
FJAT-10615 0 0 0.83×103 2.56×103 0
0 0
5.77×103
3.75×103
FJAT-10632 9.78×103 2.56×103
1.78×103
2.73×103 1.73×103 0.65×103 9.58×103 4.53×103 4.33×103 FJAT-10433 0 0 0
3.56×103 0.86×103 1.47×103 11.77×103 6.33×103 2.17×103 FJAT-11012 0 0 0 0 0 0 0 5.78×103
5.63×103 FJAT-10619 0 0 0 0 0 0 0 0 5.69×103
FJAT-10800 7.73×103 4.57×103 0
3.79×103 0 0 15.63×103 0
0 FJAT-10161 0 0 3.08×103 0 0 0 0 0 0 FJAT-11086 0 0 4.17×103 0 1.26×103 0
0 0 0
FJAT-10417 0 0 3.57×103 0 0 0
FJAT-10623 0 0 6.49×103
0 0 3.27×103
6.95×103 11.41×103 19.37×103 FJAT-10620 0 0 0 0 0 0
0 0 27.48×103 FJAT-10617 0 0 3.64×103 0
0 2.05×103 0 0 5.43×103 FJAT-10625 0 0 0 0 0 1.16×103
0 0 10.41×103 FJAT-11010 0 0 0
0 0 0 15.84×103 0
FJAT-10162 0 0 2.45×103 0
0 0
0 0
FJAT-11022 0 0 0 0 0
1.45×103
0 1.66×103 2.21×103 FJAT-11007 0 0 0 0 0 3.22×103 0 1.45×103
3.16×103
FJAT-10421 0 0
0 0 3.96×103 0 0
FJAT-11094 0 10.32×103 0
0 1.35×103 1.21×103 0 18.48×103 0 FJAT-10635 0
1.3×103 0.62×103
0 11.48×103
FJAT-10818 0 9.62×1030 0 0 0 0 0 23.48×103 FJAT-10634 0 0 0 0 0 3.92×1030 0 9.48×103 FJAT-10427 0 0 0 0 0 3.25×1030 0 0
FJAT-10425 0 0 0 0 0 3.37×1030 0 0
FJAT-11084 0 0 2.49×1030 4.78×1030 0 0 0
FJAT-10618 6.47×1030 0 4.35×1030 0 0 0 8.48×103 FJAT-11091 0 0 0 0 4.35×1030 0 0 0
FJAT-10629 0 0 0 0 0 2.19×1030 0 14.48×103 FJAT-10420 0 9.41×1030 0 0 3.21×1030 0 0
FJAT-11013 0 0 0 0 0 0 0 9.48×1030
FJAT-10430 0 0 0 0 0 3.43×1030 0 0
FJAT-10636 0 0 0 0 0 0 0 0 3.48×103注：“1”代表在此部位存在，“0”代表不存在
“1”means it is in this part, “0”means not exist
图4柑橘内生细菌聚类分析
2.4柑橘不同器官内生细菌群落多样性指数
柑橘内生细菌群落结构的多样性分析：柑橘不同器官内生细菌的群落多样性指数不同，蜜桔叶片的SIMPSON（D）指数最高为0.9235，红心柚根部最低为0.6570；蜜桔叶片的SHANNON（H1）指数最高为3.8203，红心柚根部最低为1.5641；蜜桔根部Pielou指数最高值为0.9879，蜜桔枝条最低为0.8956。
表4 柑橘不同器官内生细菌群落多样性指数
Table 4 Diversity index of endophytic bacterium in different citrus organs
植物器官
SIMPSON（D）SHANNON(H1) 均匀度(J) Organ
红心柚根0.6570 1.56410.9869
枝0.7633 2.17110.9350
叶0.8633 3.00340.9475蜜桔根0.7923 2.29380.9879
枝0.7929 2.51440.8956
叶0.9235 3.82030.9551金桔根0.7291 1.93950.9698
枝0.8551 2.99470.9015
叶0.9049 3.68950.9026
3讨论
细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类，随着科技的发展，一系列商品化自动鉴定系统相继推出，如VITEK系统、MIDI系统、Biolog系统、SENSITITRE系统、AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCA系统等[23, 24]，其中细胞脂肪酸分析的MIDI系统、碳源利用分析的Biolog系统与DNA序列分析的16S rRNA基因进化发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴定常用的技术手段[25, 26]。MIDI系统主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸( Phospholipid fatty acid，PLFA)的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析[27]。
本研究采用常规分离法分离得到140株内生细菌，通过MIDI系统鉴定技术，其中相似性系数大于0.500的菌株有109株，属于32个种，隶属于17个属。在所分离得到的内生细菌中还有31株的SI系数小于0.500，并不能确定其种属，所以柑橘中的内生细菌资源有很大的开采空间。不同品种柑橘和不同器官内生细菌的丰富度和种群数量有很大差异，内生细菌含量金桔>红心柚>蜜桔，不同的内生细菌在不同种类的柑橘中出现的频次不同，这可能是内生细菌对宿主的选择性及适应性所导致的结果；柑橘不同器官内生细菌含量也很大差异，叶片、枝条和根部内生细菌含菌量规律为根部内生细菌含量均大于枝条和叶片内生细菌的含量这与罗永兰等[17]的结果相符合。
内生细菌中Bacillus（芽孢杆菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）为最常见菌属，且芽孢杆菌的含量是最大的[28]。与罗永兰等[17]研究相比较，本研究得到的柑橘内生细菌只有Bacillus（芽孢杆菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属）与其得到的结果相同，这说明不同品种柑橘内生细菌的种类是有所差异的。红心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌.....................................................................。植物内生菌的分布与群落结构不仅与植物的种类、基因型有关，还与植物的生长阶段、环境条件有关，存在复杂的多样性[29]。
已有研究表明，Staphylococcus（葡萄球菌属）、Microbacteria（微杆菌属）、Acinetobacter（不动杆菌属）、Curtobacteria（短小杆菌属）细菌存在于奥林达夏橙中[30]。Brevibacillus（短芽孢杆菌属）[31]、Methylobacteria （甲基杆菌属）[32]、Pectobacteria（果胶杆菌属）[33]、Arthrobacter（节细菌属）[34]、Stenotrophomonas（寡养单胞菌属）[35]、Brevundimonas（短波单胞菌属）、Sphingobium（鞘脂菌属）[36]、Cedecea（西地西菌属）[37]、Delftia（代尔夫特菌属）[14]、Zoogloea（动胶菌属）[38]等，这些细菌作为内生细菌已经从不同的植物中分离到，且有些细菌生物学特性都已有不同程度的研究。Araújo等[32]在研究内生细菌与木质部难养菌（Xylella fastidiosa）的相互作用时发现，在被Xylella fastidiosa侵染而不表现症状的柑橘植株中，内生细菌Curtobacterium flaccumfaciens的数量相比健康植株大量增加，而且能够减轻由X. fastidiosa引发的症状。Microbacterium（微杆菌属）能够合成黄原胶降解酶，将植物病原菌野油菜黄单孢菌分泌的毒素因子黄原胶分解，生成一些具有抗微生物生长的物质[39]。
有大量研究表明内生细菌群落结构与自身生长环境，营养条件，遗传背景有关[40]。多样性指数可做为度量微生物群落多样性高低的指标。陈俊华等[41]指出SHANNON（H1）指数反映群落物种丰富度，SIMPSON
（D）指数反映群落中物种的多少，Pielou指数反映群落物种均匀度。本研究发现柑橘不同器官的内生细菌群落多样性不同，柑橘内生细菌群落结构的多样性分析：柑橘不同器官内生细菌的群落多样性指数不同，蜜桔叶片内生细菌的SIMPSON（D）指数最高，红心柚根部最低；蜜桔叶片内生细菌的SHANNON（H1）指数最高，红心柚根部最低；蜜桔根部内生细菌Pielou指数最高，蜜桔枝条最低。
本研究从3种柑橘健康植株为样品，分析了福建顺昌柑橘植株内生细菌的群落多样性，获得到健康柑橘植株内生细菌的优势种群，并了解不同柑橘内生细菌的群落多样性及其分布特性，为深入研究内生细菌与柑橘植株生长之间的相互作用提供了理论基础。
4参考文献
[1] 张珉, 钟晓红. 柑橘功能性成分研究进展[J]. 中国农学通报, 2009,25(11):137-140.
[2] 冉德森, 周国斌. 我国柑橘产业发展前景预测[J]. 湖北植保, 2009(005):43-44.
[3] 陈仕俏, 赵文红, 白卫东. 我国柑橘的发展现状与展望[J]. 农产品加工. 学刊, 2008(003):21-24.
[4] H ALLMANN J, Q UADT-H ALLMANN A, M AHAFFEE W F, et al. Bacterial endophytes in agricultural crops [J]. Canadian
Journal of Microbiology, 1997, 43(10):895-914.
[5] D I F IORE S. Endophytic bacteria: their possible role in the host plant S. Di Fiore1 and M. Del Gallo Dept. of Food
Technology, Environmental and Microbiological Sciences, University of Molise, 1-86100 Campobasso, Italy [J].
Azospirillum 6 and related microorganisms, 1995:169.
[6] K HAN Z, D OTY S L. Characterization of bacterial endophytes of sweet potato plants [J]. Plant and soil, 2009,
322(1):197-207.
[7] S INGH R, M ISHRA R, J AISWAL H. Role of rhizobial endophytes as nitrogen fixer in promoting plant growth and
productivity of Indian cultivated upland rice (Oryza sativa L.) plants [J]. Biological Nitrogen Fixation, Sustainable Agriculture and the Environment, 2005:289-291.
[8] S TROBEL G, D AISY B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products [J]. Microbiology and
Molecular Biology Reviews, 2003, 67(4):491.
[9] S TROBEL G, D AISY B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products [J]. Microbiology and
Molecular Biology Reviews, 2003, 67(4):491.
[10] 姜怡, 杨颖, 陈华红, 等. 植物内生菌资源[J]. 微生物学通报, 2005,32(006):146-147.
[11] D ENT K C, S TEPHEN J R, F INCH-S AVAGE W E. Molecular profiling of microbial communities associated with seeds of
Beta vulgaris subsp. vulgaris (sugar beet)[J]. Journal of microbiological methods, 2004,56(1):17-26.
[12] Z INNIEL D K, L AMBRECHT P, H ARRIS N B, et al. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from
agronomic crops and prairie plants[J]. Applied and environmental microbiology, 2002, 68(5):2198.
[13] G ERMIDA J, S ICILIANO S. Taxonomic diversity of bacteria associated with the roots of modern, recent and ancient
wheat cultivars [J]. Biology and fertility of soils, 2001, 33(5):410-415.
[14] S UN L, Q IU F, Z HANG X, et al. Endophytic bacterial diversity in rice (Oryza sativa L.) roots estimated by 16S rDNA
sequence analysis [J]. Microbial ecology, 2008, 55(3):415-424.
[15] S ESSITSCH A, R EITER B, P FEIFER U, et al. Cultivation‐independent population analysis of bacterial endophytes in three
potato varieties based on eubacterial and Actinomycetes‐specific PCR of 16S rRNA genes[J]. FEMS microbiology ecology, 2002, 39(1):23-32.
[16] 韩继刚, 宋未. 植物内生细菌研究进展及其应用潜力[J]. 自然科学进展, 2004,14(4):374-379.
[17] 罗永兰, 张志元, 喻珺. 柑橘内生细菌的分离与鉴定[J]. 湖北农业科学, 2006,45(006):773-775.
[18] 张翼, 白晨, 冉国华, 等. 柑橘内生细菌YS45 的鉴定, 抗菌物质分析及其对油菜菌核病的防治作用[J]. 植物病理学报,
2009(006).
[19] Lacava P T, Araujo W L, Marcon J, et al. Interaction between endophytic bacteria from citrus plants and the
phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa, causal agent of citrus‐variegated chlorosis[J]. Letters in applied microbiology, 2004,39(1):55-59.
[20] 袁红旭, 陈勇明, 何财能, 等. 拮抗炭疽病的柑橘内生细菌的分离与筛选[J]. 果树学报, 2005,22(005):510-513.
[21] 蓝江林, 刘波, 朱育菁, 等. 茄子植物内生细菌群落结构与多样性[J]. 生态环境学报, 2009,18(004):1433-1442.
[22] 车建美; 刘波; 张彦等, . 几种禾本科牧草内生细菌的分布特性[J]. 草业学报, 2010. 19(003): 124-131.
[23] S TAGER C E, D AVIS J R. Automated systems for identification of microorganisms.[J]. Clinical microbiology reviews,
1992, 5(3):302.
[24] 李琳, 李槿年, 余为一. 细菌分类鉴定方法的研究概况[J]. 安徽农业科学, 2004,32(003):549-551.
[25] 吴愉萍, 徐建明, 汪海珍, 等. Sherlock MIS 系统应用于土壤细菌鉴定的研究[J]. 土壤学报, 2006,43(4):642-647.
[26] 冯瑞华, 樊蕙. Biolog 细菌自动鉴定系统应用初探[J]. 微生物学杂志, 2000,20(002):36-38.
[27] I BEKWE A M, K ENNEDY A C. Fatty acid methyl ester (FAME) profiles as a tool to investigate community structure of two
agricultural soils[J]. Plant and Soil, 1999,206(2):151-161.
[28] 邹文欣, 谭仁祥. 植物内生菌研究新进展[J]. 植物学报, 2001,43(9):881-892.
[29] 马同锁，田苗珍，袁红楼等, 不同生长环境对2 种蔬菜内生菌分布的影响. 安徽农业科学, 2009. 37(17): 7812-7815.
[30] 王爱华, 殷幼平, 熊红利, 等. 广西柑橘黄龙病植株韧皮部内生细菌多样性分析[J]. 中国农业科学,
2010,43(23):4823-4833.
[31] M UNDT J O, H INKLE N F. Bacteria within ovules and seeds.[J]. Applied and Environmental Microbiology,
1976,32(5):694.
[32] A RAUJO W L, M ARCON J, M ACCHERONI J R W, et al. Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction
with Xylella fastidiosa in citrus plants[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002,68(10):4906.
[33] 朱育菁, 王秋红, 陈璐, 等. 龙眼内生菌的分离与脂肪酸鉴定[J]. 亚热带植物科学, 2008,37(004):22-25.
[34] G ARDNER J M, F ELDMAN A W, Z ABLOTOWICZ R M. Identity and behavior of xylem-residing bacteria in rough lemon roots
of Florida citrus trees[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 43(6):1335.
[35] W OLF A, F RITZE A, H AGEMANN M, et al. Stenotrophomonas rhizophila sp. nov., a novel plant-associated bacterium
with antifungal properties[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2002,52(6):1937. [36] R ASCHE F, V ELVIS H, Z ACHOW C, et al. Impact of transgenic potatoes expressing anti‐bacterial agents on bacterial
endophytes is comparable with the effects of plant genotype, soil type and pathogen infection[J]. Journal of applied ecology, 2006,43(3):555-566.
[37] V EGA F E, P AVA R IPOLL M, P OSADA F, et al. Endophytic bacteria in Coffea arabica L.[J]. Journal of basic microbiology,
2005,45(5):371-380.
[38] H UREK T, R EINHOLD-H UREK B, V AN M ONTAGU M, et al. Root colonization and systemic spreading of Azoarcus sp. strain
BH72 in grasses.[J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(7):1913.
[39]韩秋惠, 李冲伟, 王梅, 等. 新分离Microbacterium sp. XT11 菌产黄原胶降解酶生产条件的优化研究[J]. 生物技术
通报, 2006(C00):469-471.
[40] 谢钟琛. 福建省柑橘黄龙病危害及其流行规律研究[J]. 中国农业科学, 2009, 42(11): 第3888-3897页.
[41]陈俊华, 文吉富, 王国良, 等. Excel 在计算群落生物多样性指数中的应用[J]. 四川林业科技, 2009,30(003):88-90.
植物内生菌的分离 钱昆121140041 一、实验目的 1、掌握对植物内生菌的分离处理方法。 2、熟练掌握对细菌、真菌的染色观察技术。 3、了解微生物分子实验的基本操作流程。 二、实验原理 在植物的生态环境中，存在着各种各样的微生物,它们有的附着于植物的表面，有的则生活于植物体内。对于附着于植物表面和根际的微生物已有很多研究，而对于植物体内微生物的研究却刚刚起步。但有资料显示, 一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。因此，合理利用植物的内生微生物具有重要的理论意义和实用价值。植物内生菌作为微生物研究领域之一，近年来一直备受关注。 内生菌概念在1866年首先由Bary提出的，指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物（主要为真菌和细菌）。其后的很长时间内，内生菌研究进展缓慢。直到1993 年，美国蒙大拿州立大学Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部位分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，从而启发人们可从植物内生菌寻找与植物产生的相同或相似的化合物，由此促进了植物内生菌的研究。植物内生菌为植物组织内的正常菌群，包括植物内生真菌、内生细菌和内生放线菌，广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中。 内生真菌是在宿主植物的茎和叶内生存并完成生活周期的真菌。这类真菌中，有许多种类很少形成孢子，或者在宿生植物上形成孢子（或者孢子果），不容易识别。真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间。与病原菌不同，这些真菌对宿主植物几乎没有害处，它们和植物之间或者是相互依存的共生关系，或者是不太密切的共生关系。 对于现已分离得到的植物内生细菌，一般可分为专性内生细菌与兼性内生细菌，前者指至今只能在植物体内分离得到的细菌；后者指能在植物根际与土壤中分离得到，也能在植物体内分离得到的细菌，而且种类居多。根据内生细菌对宿主植物生长发育的影响可以将其分成三类：第一类对植物的作用是中性的，即尚未发现它们的内生定殖对宿主植物生长与繁殖有影响；第二类对植物生长发育有促进作用，如能提高宿主植物抗病、抗逆能力，或能通过固氮与分泌激素促进植物生长发育等；第三类对植物生长具有负面影响，在特别条件下接种到原宿主植物或另外的宿主植物会诱发植物病害。但需要注意的是，同种细菌定殖于不同宿主植物可能对宿主植物产生不同的影响。 除根瘤菌外，还有放线菌侵入多种被子植物宿主，形成根瘤的共生固氮体系。早在十九世纪后期，人们就发现了这类非豆科的根瘤，并发现根瘤内有生微生物，1881年布隆科斯特将它称为Frankia，但当时并不知道它是什么微生物。确定内
柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性 孙大光1,2，郑雪芳2，刘波2 ，阮传清2，范国成2，夏育陆3，Hall D.4，段永平4 （1福建师范大学生命科学学院，福州350108；2福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心，福州350003；3美国北卡州立大学有害生物综合治理研究中心, 美国；4美国农业部佛罗里达园艺试验室，弗罗里达34945） 摘要：对红心柚、蜜桔、金桔内生细菌进行分离鉴定并做多样性分析，为研究柑橘内生细菌与柑橘病害的生物防治奠定基础。平板分离法分离柑橘不同器官内生细菌，采用美国MIDI微生物鉴定系统鉴定菌株，对内生细菌数量进行统计、分类，并作群落多样性分析。3种柑橘共分离得到的内生细菌属于32个种，隶属于17个属。红心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌10个属13个种，14个属22个种，12个属21个种。不同种类细菌中芽孢杆菌属细菌含量最高，3种柑橘中金桔的内生细菌含量最高，不同器官中根部的内生细菌含量最高。柑橘内生细菌进行聚类分析表明，。。。。。。。。。。。。。。。。。。。在不同柑橘和不同器官中内生细菌的种类、数量和群落多样性存在较大差异。蜜桔叶片内生细菌的SIMPSON（D）指数最高；蜜桔叶片内生细菌的SHANNON（H1）指数最高；蜜桔根部内生细菌Pielou指数最高。本研究丰富了柑橘内生细菌资源，为柑橘内生细菌的利用提供了物质基础，并对科学说明生防作用机理具有重要价值。 关键词：柑橘内生细菌PLFA多样性分布 S eparation, identification and distribution of endophytic bacteria in citrus SUN Da-guang1，2，ZHENG Xue-fang2，LIU Bo2*, RUAN Chuan-qing2, FAN Guo-cheng2, XIA Yu-lu3, Hall D.4, DUAN Yong-ping4 1. College Of Life Science Fujian normal university, Fuzhou 350108, China; 2.Citrus Huanglongbing Research Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China； 3. The Center of Integrated Pest Management, North Carolina State University, North Carolina, USA； 4. Horticultural Research Laboratory (USDA/ARS), Florida, 34945, U.S.A Abstract: In order to ascertain the connection between citrus endopphytic bacteria and the Biological control about citrus Disease, the study on the citrus endophyte’s number, bacteria’s identification and community multiplicity analysis were conducted. The endophytic bacteria were isolated using the culture method and identified by Microorganism Identification System (MIDI system produced by USA). 32 microbial species identified belonging to 17 genera of bacteria were detected from endophytic bacteria in Citrus grandis Osbeckcv, Chinese honey orange and Cumquat. The content of Bacillus was the most in all endophyte, Cumquat’s endophyte was the most among 3 these citrus and the number of endophytic bacteria in root was more than other organs. The cluster analysis results showed that 32 strains could be separated into 7 groups. The community multiplicity and diversity of endophytic bacteria were significant different in 3 different citrus. Keyword：citrus；endophytic bacteria；PLFA；community multiplicity 柑橘是世界第一大果树品种，全球有135个国家和地区生产柑橘，2008年我国成为世界柑橘第一大国[1, 2]。柑橘不仅仅口味宜人而且本身具有很多功能性物质，可广泛应用于功能性食品的开发、药物的开采及一些功能性饲料的研制等[3]。 内生细菌（endophytic bacteria）是指从经过表面消毒植物组织分离得到并不会对植物本身造成实质性伤害，而且在一定的程度上还会与植物建立和谐关系的细菌[4, 5]。其对植物的作用表现在很多方面，如有些内生细菌可以产生植物激素促进植物生长[6]，有些促进植物生物固氮作用[7]，有些可以产生抗生素增加植物对抗病原菌和外来寄生虫的抵抗能力[8]。了解内生细菌与植物生长之间的关系，并且能够将这些关系应用到农业生产、保护生物多样性以及保持农业生态平衡具有重要的意义[9]。 基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项(No.201003067-05)；中美合作项目-柑橘木虱及黄龙病野外研究(No.2010-1652-02)、抗虫柑橘品种研究（No.6618-22000-037-01S）；福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（No.STIF-Y03） 作者简介：孙大光（1987—），男，硕士研究生.，主要从事植物内生菌的研究，E-mail：woshisdg@https://www.doczj.com/doc/1a19308191.html, *通讯作者（责任作者）：刘波（1957—），男，博士，研究员，从事微生物生物技术与农业生物药物研究，E-mail：liubofaas@https://www.doczj.com/doc/1a19308191.html,
柑橘（福橘）健康植株根、茎、叶部位内生菌脂肪酸 生物标记的分布特性 郑雪芳、刘波*、阮传清、林营志、肖荣风、朱育菁、范国成、蔡子坚 （福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心） 摘要：对柑橘（福橘）的根、茎、叶进行磷脂脂肪酸（PLFA）测定和分布特征分析。结果表明：从柑橘植株体内检测到大量的PLFA，其中指示细菌的16:0脂肪酸生物标记量最大，指示放线菌的10Me 17:0次之，指示真菌的18:3ω6c(6,9,12)生物标记量最小。福橘不同部位内生菌的分布量不同，表现为叶片内生菌分布量最大，其次是根，茎部最少的规律。福橘植株体内优势微生物种群为指示细菌的16:00、指示真菌的18:1 w5c和指示嗜热解氢杆菌18:00，其中生物标记16:00和18:1 w5c在福橘健叶分布量最大，生物标记18:00在福橘健根分布量最大。 关键词：柑橘；内生菌；PLFA；分布 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试柑橘品种为福橘，种植于福建福州晋安区柑橘品种改良试验场，采集福橘健康植株和黄龙病发病株的根、茎、叶（图1），贮存于4℃冰箱备用。 图1 福橘健康植株 1.2柑橘内生菌脂肪酸生物标记分析方法 柑桔植株内生菌PLFA的提取步骤如下：称取10g柑桔植株不同部位（根、茎、叶）于研钵中，用液氮研磨成粉状，装入50mL离心管中，加入20 mL 0.2mol·L-1的KOH甲醇溶液，充分混匀，斡旋样品5min，100℃水浴10min（此过程为避免管内液体沸出，可先不盖离心管盖子，用保鲜膜封住管口）；加入3 mL 1.0 mol·L-1的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀；加入10 mL正已烷，充分摇匀，在2000r·min-1条件下离心15min，将上层正己烷相转入干净玻璃试管中，吹干；加入0.6mL体积比为1:1的正已烷:甲基叔丁基醚溶液，充分溶解，转入GC小瓶，用于脂肪酸测定。 PLFA成份采用美国Agilent6890N型气相色谱仪测定。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：色谱柱HP-ULTRA2（25m×0.2mm×0.33μm），分流进样，进样量lμL，分流比为100:1，载气（H2）流速为2mL· min-1，尾吹气（N2）流速为30mL·min-1。二阶程序升高柱温：以5℃min-1的速率使柱温由170℃升至260℃；再以40℃ min-1的速率升温至310℃，保持90s。汽化室温度为250℃，检测
植物内生菌的研究与应用
目录 第一章植物内生菌的研究 (3) 第二章分离过内生菌的植物种类 (17) 第三章植物内生菌种类 (122) 第三章相关作物内生菌的研究 (165) 第四章植物内生菌研究参考文献 (166)
第一章植物内生菌的研究 1 内生菌的发现和定义 植物体内普遍存在着内生菌，但是由于这些内生菌生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，所以内生菌的存在和作用长期以来被忽视。直到20世纪30年代，发现造成畜牧业重大损失是由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，这才开始对内生菌的深入研究(Leuchtmann A 1992)。1886年，德国科学家Barry首先提出了内生菌一词“endophyte”(李能章彭远义2004)。Carrol在1986年将内生菌阐述为生活在地上部分、活的植物组织内不引起明显症状的微生物(何劲刘蕴哲康冀川2006)。1991年，Petrini提出内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内不引起植物明显病害的微生物(Petrini O 1986)。1992年Kleopper等认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出“植物内生细菌”的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌(何红邱思鑫胡方平关雄2004)。1997年Hallmann对植物内生细菌的概念进行补充，认为植物内生细菌是从表面消毒组织中分离得到或从植物内生细菌是从表面消毒的植物组织中分离得到或从植物内部汁液获得的，并对植物表观上无危害及明显症状的，但它们的存在并未使植物的表型特征和功能有任何改变的细菌(Hallmann J Kleopper J W Rodriguez-Kabana R 1997)。目前，较被公认的定义为：指那些在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或者细菌，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在症状。可以理解为植物内生菌为植物组织内的正常菌群，是植物微生态系统中的天然组成成分，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内生共生微生物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物。可以通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织和汁液中分离获得，或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明内生菌的存在。现在内生菌的概念是一个生态学概念，而非分类学单位。目前，内生菌泛指一切生活在植物体内的腐生，寄生和共生的真菌、细菌、放线菌等微生物。 2 内生菌的研究现状 2.1 内生菌的生物多样性 内生菌分布广，广泛分布于低等和高等植物，目前已从几百种禾本科植物，上千种双子叶，单子叶植物中分离到内生菌(姜怡杨颖陈华红2005)。其中研究较多的植物有牧草，棉花，小麦，高粱，马铃薯，玉米，甘蔗，甜菜，黄瓜，水稻，柠檬等。内生菌几乎存在于植物的所有组织中，不仅存在于植物的根、茎、叶、花、果、胚、种子中，研究发现内生菌还存在于植物的根瘤中，1997年，Sturz等从红三叶草根、茎、叶及根瘤中分离到内生细菌(SturL A V Christie B R Matheson B G 1997)。 内生菌的种类也十分繁多，包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。1948年Tervet 和Hollis 首次用热处理和纯培养的方法分离马铃薯、胡萝卜、红甜菜和甘蓝贮藏器官的内生细菌，证明了植物体内生细菌是一个混杂的细菌群，同时对这两个细菌群的进行初步鉴定(Tervet I W Hollis J P 1948)。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌以超过129种率属于54个属(Tervet I W Hollis J P 1999)，这些内生细菌大多为土壤微生物，主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)等(Zou W X1993)，另外还发现了一些内生细菌新的分类单位，如金杆菌属(Aureobacterium.sp )的一个种、栖稻黄色单胞菌(Flavimonas oryzihabitans)，人苍白杆菌（Ochrobatrum arthropi）等(杨海莲孙晓璐宋未1998)。；内生放线菌主
植物病原细菌鉴定实验指导 一、实验目的 了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和 生化鉴定技术。 二、实验原理 细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。一般细菌的形态学特征，如 生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生 化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要 通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA 指纹。 三、实验步骤 1、样品收集和处理 收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植 株或部位作为样品。将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙 醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。 2、分离与纯化 将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富 营养培养基有利于分离病原菌。将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。 3、形态学鉴定 观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。如 分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定 的重要参考标准。 4、生理生化鉴定 通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法 可以判断病原菌的代谢类型。如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一 步分类和鉴定细菌的能力。 5、分子生物学鉴定
柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析 孙大光;郑雪芳;刘波;阮传清;夏育陆;段永平 【摘要】Nested-PCR detection of Shunchang citrus Huanglongbing pathogen was carried out in this study. Phylogenetic tree based on rDNA sequencing was built to find out the evolutionary between different parts citrus HLB pathogens. Digesting the target DNA fragment of 16S rDNA with restriction enzyme Xbal was carried out to confirm the species of Shunchang Huanglongbing pathogen. The results showed that there were 7 positive detections in 12 selected samples, and the rate of positive detections was 58.33%, and four were dominant character, three were recessive character. The results showed that Shunchang citrus Huanglongbing pathogen belong to Candidatus Liberibacter asiaticus based on the 16S rDNA phylogenetic analysis and restriction enzyme Xbal digestion analysis. And 16S rDNA sequence gap analysis showed that the difference between Ca. L. Asiaticus and Ca. L. Africanus, Ca. L. Africanus and Ca. L. Americanus, Ca. L. Americanus and Ca. L. Asiaticus were 2.75%, 3.90%, 3.44%, respectively.%采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化
细菌分离与鉴定方法 1.纯培养 纯培养是将混合细菌通过稀释法或不同稀释度悬浮液的涂布、扩散或 稀释平板接种法接种在适宜的培养基上，使各菌种生长成独立的菌落。这 样可以得到洁净的菌液或洁净的菌落。 2.菌落形态观察 经纯培养得到菌落后，可以观察菌落特征，如菌落形状、颜色、大小、边缘等。这些特点有助于初步区分不同的菌种。 3.各种培养基的利用 根据细菌对不同种类培养基的利用差异，可以采用不同种类培养基进 行分离与鉴定。例如，选择亲水性对细菌有选择性的培养基可以分离出产 胆红素的细菌。 4.微生物常规方法 利用常规的生理生化特性进行鉴定，包括氧需求情况（需氧、厌氧、 需气氛）、产气性、产酸性、产胆红素等特征。 5.细胞形态与结构鉴定 利用显微镜观察细菌的形态特征，包括形状、大小、聚集方式等。染 色方法，如革兰氏染色和抗酸染色，可以帮助确定细菌的细胞壁结构、染 色性质、胞内结构等。 6.生化反应测试
通过观察细菌在特定生化反应条件下产生的能量代谢产物，如产气、 酸碱反应等，可以推测出细菌的代谢途径和能力。常用的生化反应试剂盒，如API系统和VITEK系统，可以通过细菌的酶活性、营养利用和代谢产物 等参数对细菌进行鉴定。 7.16SrRNA基因分析 16SrRNA基因是细菌特有的核糖体RNA的组成部分，其序列具有高度 保守性和广泛分布性。通过对16SrRNA基因的测序和比对，可以确定细菌 的亲缘关系和系统发育位置，进而确定细菌的名称和分类。 细菌分离与鉴定方法的选择取决于需求和目标。对于一般的实验室课 程或常规鉴定需要，常规的菌落形态观察、生理生化试验和染色方法可以 满足要求。而对于复杂的鉴定和分类，特别是对于新菌种或未知细菌的鉴定，16SrRNA基因分析是一种非常有力的方法。
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目前国内外尚未见有关香椿树内生细菌及其与生理活性物质关系的研究报道。 为了能较全面客观的研究香椿树内生细菌多样性及获得更多的香椿树内生细菌 资源。因此，本研究以香椿叶为研究材料，探讨香椿叶表面灭菌的最佳条件， 以及8种常用的细菌分离培养基对香椿叶内生细菌的分离效果。本研究结果可 为选择合适的表面灭菌条件及培养基分离香椿叶内生细菌提供参考以及为进一 步深入探讨研究抗香椿树病虫害的菌株质及为香椿树病虫害防治提供依据。 1.2 国内外研究现状分析 关于内生细菌的研究主要是集中在内生细菌的有益生物学作用，及内生细菌与 寄主植物互作的生态学研究。植物内生细菌由于其与寄主植物具良好的亲合能力，可系统的分布于植物细胞间隙或细胞内，有足够 的营养物质，并受到植物组织的保护，可避免外部恶劣环境的影响，相对于植 物附生细菌更易发挥生防作用。因此，内生细菌的应用广泛受到人们的重视。 通过对内生菌的不断研究, 学者们在甘蔗的根、茎、叶内发现存在有大量的新 型内生固氮菌重氮营养醋杆菌，这种内生菌具有严格的寄主专一性, 强的抗酸 能力,能在高糖环境中生长和保持高效的固氮活性并与甘蔗建立联合固氮作用。此外，杨海莲等从水稻中分离出的内生细菌阴沟肠杆菌 MR12(Enterobactercloacae) 不仅具有固氮活性，而且对水稻稻瘟病和纹枯病 具有较好的防治能力。 内生菌还能产生促植物生长物质，如植物生长素、赤霉素以及细胞激动素等， 直接促进植物生长。张集慧等从兰科药用植物中分离出5种内生真菌，并从这 些真菌发酵液和菌丝体中分别提取出5种植物激素，如赤霉素、阴哚乙酸、脱 落酸、玉米素、玉米核苷等，它们对兰花的生长发育有较好的促进作用。郭顺 星等对我国云南、四川等地采集的野生铁皮石斛和金钗石斛根中的内生真菌进 行分离并测定其生物活性。测定结果表明，其中5种真菌可促进铁皮石斛种子 萌发；3 种真菌可与铁皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系并促进幼苗的生长。 目前，通过对一些药用植物的研究发现其某些内生菌可以产生与宿主植物相同 或相似的药用成分，为药物生产开辟了新途径，为人类解决某些药用植物生长 缓慢、资源紧缺等因素带来的药源紧张和生态破坏问题提供了新的思路。紫杉 醇是由Wani等分离自短叶红豆杉的一种二萜类生物碱，具有独特的抑制微管解聚和稳定微管的作用,是目前从植物中发现的最重要的抗癌药物之一，对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、直肠癌等均有疗效。至今已从南方红豆杉、中国红豆杉、东北红豆衫、云南红豆杉等多种红豆杉属植物中分离到能够合成紫杉醇类 化合物的内生菌。植物内生菌能产生多种抗生素，如肽、有机酸、萘等。Strobel G 等从雷公藤(Tripterygium wilfordii)的茎中分离到一株内生真菌，能产一种肽类抗生素，与棘白霉素和肺炎球菌素的化学性质相似，它不但能 抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等一些植物病原真菌，对白色念毛霉及发癣 菌也具有强烈抑制和杀灭作用，还能抑制白假丝酵母(Candida albicans)等人 类病原真菌。在植物内生菌中转入抗病抗虫基因，将其作为外源基因载体是现 在植物病虫害生物防治又一新思路。在植物中直接转入抗病虫
内生菌分离与鉴定 内生菌是人体和动物体内与其共存的一类细菌，它们与宿主有着千丝万缕的联系，并且对宿主的健康有着显著的影响。然而，因为人们对内生菌的认知非常有限，因此，内生菌的分离和鉴定就变得尤为重要和迫切。 分离内生菌包括众多步骤，如分离、萃取、纯化、活性测试、形态特征测定、抗菌试验、荧光打印等。最先进的技术通常采用热抽提液体状菌株（LRS），并且可以在室温和限制的湿度条件下分离获得最纯的样品。抽提液体菌能够有效地避免细菌传播，同时也能够有效增加细菌的丰度。 在传统的鉴定方法中，最常采用的是质萃取，它能够增加培养基的密度以及细菌的分离效率，从而可以有效地提高内生菌的收集率。此外，质萃取还能够抑制情报细菌的生长，从而有助于内生菌的纯度。 另外，细菌的分离和鉴定也可以通过细菌杂交、PCR（聚合酶链反应）和荧光原位杂交（FISH）来实现。细菌杂交是一种早期被开发出来的技术，可以有效地为研究者找出不同细菌中的特定DNA序列。而PCR是一种形式丰富的技术，能够检测细菌的基因组组成，以及细菌的基因序列。而FISH是一种有效地检测和分类细菌的有用技术，它可以有效地从其他细菌中隔离内生菌株。 最近的技术正在发展出可以有效检测细菌的分子克隆技术。这项技术可以分析细菌的基因组，从而可以更准确地识别和鉴定目标
样品中的内生菌。此外，分子克隆技术还能够有效构建微生物群落，以便更客观地评估内生菌的群落结构，并且它还可以有效地分析内生菌的变化情况。 总之，分离和鉴定内生菌是一个复杂的过程，它可以有效地帮助研究者了解动物和人体内部的内生菌组成，以及它们如何影响宿主的健康状况。因此，未来在内生菌分离和鉴定方面的研究将越来越受到重视，以深化我们对内生菌的认识和理解。
内生菌研究方法 1. 内生菌鉴定方法：内生菌的鉴定通常使用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，通过与数据库比对确定内生菌的亲缘关系。 详细描述：内生菌鉴定的第一步是提取内生菌的基因组DNA或RNA。常用的提取方法 包括CTAB法、酚/氯仿法等。提取的DNA或RNA可以被用于进行下一步的分子生物学分析。 鉴定内生菌的常用方法是通过对内生菌的16S rRNA序列进行分析。16S rRNA在细菌中广泛存在，并且具有高度的保守性和进化慢的特点，因此可以用于鉴定和比较不同细菌之 间的亲缘关系。通过PCR反应扩增16S rRNA基因片段，并对扩增产物进行测序。然后将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，以确定内生菌的亲缘关系。 2. 内生菌定量方法：内生菌定量可以通过菌落计数、实时荧光定量PCR等方法进行。 详细描述：菌落计数是一种常用的内生菌定量方法。它通过将样品均匀涂布在含有适 宜培养基的琼脂平板上，然后将平板在适宜的温度下孵育一段时间。善生长的内生菌会形 成可见的菌落，通过计数菌落的数量可以间接估计内生菌的含量。 实时荧光定量PCR是一种准确且高灵敏度的内生菌定量方法。它利用了PCR反应的指 数增长特性，通过测量反应体系中荧光信号的增加来实现对内生菌数量的定量。内生菌的 数量可以通过与已知浓度的标准曲线进行比较得出。 3. 内生菌培养方法：内生菌的培养方法主要有直接法和间接法两种。 详细描述：直接法是将内生菌从宿主组织中直接分离出来，利用含有适宜营养物质的 培养基对菌株进行培养。该方法可以获得与宿主组织中内生菌具有相似生理特性的纯培养 菌株，但存在着很大的困难，因为内生菌通常不能在人工培养条件下生长。 间接法是通过将宿主组织进行处理，如消毒、切碎等，然后将处理后的组织置于含有 营养物的培养基中进行培养。内生菌在处理后的组织中可以继续生长，并在培养基上形成 菌落。间接法相对直接法容易操作且成功率较高，但获得的菌株可能受到宿主组织中其他 微生物的污染。 4. 内生菌分离方法：内生菌的分离方法包括物理分离和化学分离两种。 详细描述：物理分离是将宿主组织进行机械碾磨、切碎或研磨等处理，将内生菌与宿 主细胞分离开来。然后，将分离得到的菌浆进行稀释，然后将其涂布在含有适宜培养基的 琼脂平板上进行培养，以获得单个内生菌菌落。
内生菌分离与鉴定 内生菌是一类重要的细菌，在人体内有着重要的生物学作用，如参与营养、抗疾病、维持生理功能等，可以改善人体健康状况，从而为人类提供有益的服务。然而，在不同的环境和条件下，内生菌存在着差异性。因此，有必要通过内生菌的分离和鉴定，来掌握这些细菌的生物学特性，以便依此应用于相应的生物领域。 内生菌的分离与鉴定包括多种步骤，在此过程中，必须使用大量的实验工具和技术，以确保分离过程的高效性和准确性。首先，根据不同的细菌种类，对病原微生物进行预处理，包括萃取、培养、分离和清洗等。其次，使用膜过滤法将目标微生物从其他杂质中分离出来，以节约实验时间，提高实验效率。再次，通过检测膜的细菌学特性，进行细菌的组织型判断。最后，结合实验室技术检测手段，如血清学、发酵学、酶学等，进行内生菌的有效鉴定，以全面掌握病原菌的形态、营养特性、生物活性、药物敏感性等特征，从而为临床诊断和治疗提供依据。 此外，内生菌分离与鉴定是一个复杂的过程，其关键是高效分离。因此，在培养过程中，需要采用单菌特异性培养基，以便于避免其他非目标菌的阻碍，从而更有效地分离出理想的菌株。此外，内生菌在培养过程中，也要求有足够的氧气，以满足微生物的生长和发酵，特别是对于大量杂质较多或高温环境下会影响微生物的发酵，显微法拍摄时也要给予足够的补光，以减少影响。 最后，内生菌的分离与鉴定需要采用大量的实验技术和技术，同
时要求严格控制实验过程，以确保实验数据的准确性和可靠性。只有在这种前提下，才能充分发掘内生菌的生物学特性，并有效应用于相关的生物学研究和应用中，从而为人类健康服务。 总之，内生菌分离与鉴定是一个需要仔细规划，精密操作，以达到更高效，更准确的目的的过程。它依赖于实验技术和设备，精确检测细菌的生物性质，从而为有效分离和辨认病原菌提供科学依据，为增强人体免疫力和抗疾病提供可靠的药物和技术支持，从而起到促进健康的重要作用。
细菌分离与鉴定实验报告 引言 细菌分离与鉴定是微生物学领域中的一项重要实验技术。通过该实验，我们可以将复杂的细菌群体分离出单一细菌菌株，并对其进行鉴定和分类。本实验报告将详细介绍实验步骤和结果分析。 实验材料和方法 1.实验材料： –细菌培养基 –细菌样本 –灭菌培养皿 –恒温培养箱 –微量移液器 –菌液均匀涂布器 –培养皿铺平仪 2.实验步骤： 1.从细菌样本中取一小滴，用微量移液器滴入灭菌培养皿中。 2.使用菌液均匀涂布器将细菌样本涂布在含有细菌培养基的培养 皿上。 3.使用培养皿铺平仪将培养皿铺平，确保细菌样本均匀分布。 4.将培养皿放入恒温培养箱中，设置适当的温度和时间。 5.取出培养皿，观察并记录细菌菌落的形态特征。 实验结果 在所使用的细菌样本中，我们成功地分离出了多个细菌菌株。根据观察，我们将这些菌株分为三类，分别是A、B和C。 •类别A：这类菌株呈现出圆形和平坦的菌落形态，表面光滑，边缘清晰。在培养基上呈现出浅黄色。 •类别B：这类菌株的菌落形态较类别A更为凹凸不平，表面稍显粗糙。在培养基上呈现出乳白色。 •类别C：这类菌株的菌落形态与类别A和B有较大差异，呈现出不规则形状。在培养基上呈现出淡红色。
结果分析 通过观察细菌菌落的形态特征，我们可以初步推测出这些菌株属于不同的细菌属。进一步的鉴定和分类需要进行生化试验和分子生物学分析。通过这些分析，我们可以确定这些细菌的种属、毒力和抗生素抗性等特性。 结论 细菌分离与鉴定实验是一项基础而重要的技术，它为研究细菌的特性和功能奠定了基础。通过本实验，我们成功地分离和初步鉴定了多个细菌菌株。进一步的实验将有助于更深入地了解这些菌株的特性，并为相关领域的研究提供重要的支持。 细菌分离与鉴定实验的结果对医学领域、环境科学和食品安全等方面具有重要的应用价值。在未来的研究中，我们将进一步挖掘这些菌株的潜力，探索更多关于细菌的奥秘，并为人类的健康和环境保护做出贡献。
植物内生菌及其应用研究 摘要：植物内生菌是一种新型的微生物资源，具有重大的研究意义和潜在的应用价值。本文从植物内生菌概念、起源、内生菌生物学功能及其应用等不同方面对植物内生菌在国内外的研究历史和现状进行了综述,以期更好的研究和了解植物内生菌。 关键词：植物内生菌生物多样性活性物质应用 1833年，人们发现从小麦叶片中可长出一种性质不明的锈状物，经过研究得知，这种锈状物为真菌，即现在所说的锈菌夏孢子。而内生菌(Endophyte)一词真正的提出是在1866年由De Bary首先提出，它是指在健康植物寄主中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类微生物(主要为真菌和细菌)，它生活在植物的各种组织和器官内部, 是植物微生态系统中的天然组成成分。 内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与寄主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系。一方面内生菌可从寄主中吸取营养供自己生长所需，另一方面内生菌在寄主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。有资料显示，一些植物内生微生物与宿主发生关系时，可促进植物对恶劣环境的适应, 加强系统的生态平衡,明显增强宿主的抗病性，提高植物的生产力。因此它的广泛的生物学作用及其在农业上的应用潜力已引起了人们的兴趣和关注，合理利用植物内生菌是有重要的理论意义和实用价值。本文主要综述了近年来内生菌在农业上应用的研究进展。 1、植物内生菌的起源与种类 自从1886年Bary提出内生菌概念以后的大约100年间，内生菌的研究进展缓慢。直到1993年, 美国蒙大拿州立大学Strobel从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌, 从而启发了人们可以从植物内生菌寻找植物产生的相同或相似的化合物, 进而刺激了植物内生菌的研究。 关于内生菌的起源问题有着多种假说。大致分为三类: 有人认为内生菌是通过植物种子传递给植物的；有人认为内生菌最初可能是通过对植物细胞纤维素的降解，破坏植物细胞壁，从而进入植物体内；还有人认为有的根际菌可以通过植物侧根的裂缝进入植物当中，经过长期的协同进化，与植物建立了一种和谐的内生关系, 成为内生菌。对于内生菌的起源还没有定论，笔者认为三种假说均有一定的道理, 三种途径均可能是内生菌的起源方式。 植物内生菌为植物组织内的正常菌群，它分布广，种类多广泛分布于各种陆生及水生的低等植物和高等植物中，主要包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等，几乎所有植物中都存在内生菌。
柑橘的生物特性 环境条件 柑橘,从生长、发育,直至衰老死亡,对其环境条件的要求具有规律性,这叫柑橘的生物学特性;根据柑橘生物学特性,选择适宜环境条件,才能栽培成功,并能取得大的经济效益; 1. 温度柑橘属亚热带长绿果树,性喜温暖湿润的气候,畏寒冷.因此,温度是柑橘分布与生长发育的决定因素. 适宜栽培柑橘的地区年平均气温需15---22度,冷月1--2月平均气温3度以上.不同的柑橘种类和品种,要求适宜的温度;某地能否栽培柑橘,决不能单凭年平均气温,还要考虑大于或等于10度的年积温、冷月的平均气温和极端低温出现的频率; 柑橘能忍受的最低温度叫临界低温;超过临界低温,轻者落叶,重者枯死;不同柑橘种类和品种,其临界低温不等;宜昌橙、金柑、温州蜜柑、甜橙、柠檬的临界低温分别为-15、-10、-9、-7、-3度、温度降至5--0度时果实脱落,-3时,果实冻坏;超过临界高温时55;22,引起落叶落果果实灼伤等; 果实品质与温度也有密切关系;柑橘果实发育初期,特别是成熟前,随着温度的升高,果实的含糖量升高糖酸的比例增大,酸和维生素Ｃ的含量下降,风为特别好; ２;水分是树体的主要成分之一;枝叶根的水分含量占５０％－－７５％,果实的水分在８５％以上; 年降水量１０００－－１５００毫米柑橘生长季节每月１２０－－１５０毫米的地区,适宜柑橘的栽培;我国云南南盘江年降水仅７００毫米也有大面积的柑橘栽培,主要是采用灌溉供水; 土壤中的水分含量过大,氧气供应不足,根系生长不良,甚至烂根死树;缺水则生长缓慢,成熟期推迟因此,控制土壤水分,不仅可调节空气湿度,也有利于增强树似,提高常量和品质; ３;光照光是柑橘绿色体进行光合作用的能源; 柑橘的栽培应合理密植,调整株行方向,幼树圆不间作高杆植物,以及利用山坡地栽培柑橘,都是充分利用光照条件,达到优质高产的目的; ４土壤柑橘是一种高产的果树,要求土壤条件比较严格; 1柑橘要求中性偏酸的土壤,PH值 ,但以为宜.泛有马尾松、茶、杜鹃等生长的地方,属于偏酸性的土壤,可建立柑橘园.土壤偏碱的需要改良后才可栽培; 2柑橘属深根性果树,要求土壤深度至少一米;如山地土壤成薄,需要深挖和培土,增加土壤层厚度,才能使根系发达,地上部茂盛; 3柑橘根部要求疏松、通气、排水良好的土壤,以壤土为最适宜; 4土壤有机含量达到2%以上,有利于柑橘生长发育; 5土壤条件优劣不仅关系到柑橘的产量,也直接影响到果实的品质;拘研究,土壤疏松、有机物质含量丰富的果园,果皮着色深,酸含量底,风味浓,品质好; 柑橘植株形态 柑橘的组成由：根、茎、叶、花和果实组成; 根由主根、侧根、须根及须根端着生极短的根毛构成的群体,统称为根系;压条或繁殖的植株,无主根;树干与根交界处,叫根颈; 枝干柑橘枝干由主干、主枝、侧枝组成; 叶柑橘的叶片为常绿性的单生复叶,由叶身、叶翼组成;叶翼着生在叶柄上;柑橘种类品种不同,叶的大小不等,形状各异; 柑橘根系生长特性 柑橘根系的主要功能是将树体固定在土壤中,吸收水分,矿物质；分泌有机酸,使土壤中难溶于水的物质变成易溶于水的物质,便于根系吸收；合成生长激素；储存营养物质；繁殖新植株;
植物内生菌的富集培养实验报告 l、芭蕉属植物内生菌数量、种类与植物品种有关 在对植物内生菌研究应用之前对其微生态学要有足够的了解（韩继刚等，2004)。许多研究表明植物内生菌具有宿主特异性。Adams等在研究宿主植物的基因型对棉花的内生细菌的影响中发现，宿主植物的基囚型等影响内生细菌在植株中的生存(Adams P. D. et al,2002）。另有研究报道茶树有性系后代中同一器官不同品种内生细菌数量差异显著,茶树无性系叶片、主根、侧根的内生细菌数量品种间的差异达到极显著水平（陈百文等，2008)。本研究发现不同品种芭蕉属植物内生细菌含量存在较大差别，无论是整个植株的总含菌量，还是具体到叶部、茎部、根部，均为在4个检测品种中野生蕉内生细菌含量最高，芭蕉和红花蕉含菌量最低。野生蕉、红花蕉和威廉斯蕉有分离到内生真菌没有分离到内生放线菌，而芭蕉没有分离到内生真菌，却分离到内生放线菌。显然，在芭蕉属植物中内生茵种类与品种也存在一定的关系。 2、芭蕉属植物内生菌数量、种类与植物器官有关 在同―种植物的不同器官组织中，内生菌的种类和数量也有所不同。试验结果表明红花焦和威廉斯蕉有个共同特征是根部含菌量远高于叶部和茎部。与付业勤等报道的香蕉内生细菌数量在植株根、假茎、叶柄、叶片组织的总体分布呈现递减趋势的分布结果相似（付业勤等，2007)。在其他植物上也有相似的研究结果，如哈密瓜内生细菌分布规律为种子>根>叶片>茎>叶柄>果实（罗明等，2007)。但也有辣椒叶部内生细菌的数量高于根部的报道(Quadt-Hallmann A. et al，1996)。木研究中野生蕉叶部内生细菌含量同样比根部含量高。刘云霞等认为，根系统是内生细菌进入植物的入口，因此聚集的内生细菌较多，并通过输导系统由茎部到
植物内生菌 生命科学学院2011级 2011012911 姜悦摘要：植物内生菌资源的开发作为一个新的研究领域已经引起了科学界的广泛关注，这种科学界的热点问题往往最能激起我们的求知欲。为此，通过阅读相关书籍和报刊，我写下这篇读书报告。报告主要从植物内生菌的定义、来源、运动以及应用等方面作以综述，并在结尾处提出目前植物内生菌资源开发过程中遇到的重大难题。希望通过此篇读书报告，能够让同学们产生对植物内生菌资源开发方面的研究兴趣，更重要的是鞭策自己，在科学的道路上不懈探索和前进。 关键词：植物内生菌定义来源运动应用 植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。内生菌一词“endophyte”最早是由德国科学家DeBarry于1886年提出的。此后，很多科学家给内生菌下过定义。1986年，Carrol将植物内生菌定义为生活在地上部分、活的植物组织内不引起明显症状的微生物。到了1991年，Petrini提出植物内生菌是指生活史的一定阶段生活在活体植物组织内不引起植物明显病害的微生物。次年，Kleopper等认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出了“植物理内生细菌”的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌。经过科学家们的不断探索和修正，目前，植物内生菌较被公认的定义是指那些在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或者细菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状，植物内生菌是一个生态学概念，而非分类学单位。 植物内生菌数量巨大，种类繁多，每一种生物都可能包含数百万到数千万的微生物。内生真菌广泛分布于低等植物和高等植物。已经从几百种禾本科植物，上千种双子叶、单子叶植物分离到内生真菌。内生放线菌兰克氏菌在14个科300多种非豆科植物中共生。植物体内也广泛分布着内生细菌。Mundt等分离过19个属植物的内生细菌，结果从8个属、31个种分离到细菌。从农作物中分离到50多个属的内生细菌。各种植物分离到的内生菌数量不等，有的植物只能分离到几种，而有的植物则多达上百种。通常以植物的根部、叶鞘、种子，内生真菌较多。 内生菌的分布如此之广，那么，它们是植物体内与生俱来的，还是另有其它