多克隆抗体制备免疫小鼠
简介
多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。
流程
多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：
1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，
可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。
2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠
体内，观察免疫反应情况。
3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，
获得抗体。
4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试
验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，
对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
关键步骤
抗原制备
抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。以下是一些常见的抗原制备方法：
•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。
•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。
•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。
适当的佐剂
适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的
活化。常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。
免疫小鼠免疫
将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等
方式将抗原注射到小鼠体内。注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。
血液采集和抗体收集
一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。
抗体筛选和纯化
获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进
行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。筛选出特异性较好的抗体后，可以通过亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
总结
多克隆抗体制备免疫小鼠是一种常用的实验技术，用于获
得特定蛋白质及其表位的抗体。流程主要包括抗原制备、适当的佐剂、免疫小鼠免疫、采集血液和抗体、筛选和纯化抗体等步骤。合理设计和选择抗原、佐剂以及免疫方案是制备高质量多克隆抗体的关键。通过该技术，科研人员可以获得特异性强、亲和力高的抗体，为后续的研究提供强有力的工具。
NO.9小鼠/兔多克隆抗体制备实验方案 实验原理：当将抗原注射入实验动物体内时，会引起体液免疫，一系列抗体生成细胞B 细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体，而免疫效果与抗原有关,如抗原纯度、抗原分子量、免疫原性、佐剂、抗原注射剂量、抗原免疫次数等。 实验器材：乳化器、打孔器、橡胶手套、电子天平、1ml/5ml注射器、剪刀、恒温水浴箱、EP管、移液枪、玻璃片、棉签、牙签、酒精灯、剪刀、止血钳、眼科弯镊、兔台、棉线、烧杯、离心管、冰箱、青霉素小瓶、记号笔、湿盒 实验试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、琼脂、生理盐水、PBS、70％的酒精、1.5%戊巴比妥 一、抗原的选择： 人IgG：分子量是146KD，分子量大，纯度较高，对家兔而言种属差异大，免疫原性高； 牛血清白蛋白：分子量 68KD，纯度较高、分子量大，对小鼠而言种属差异大，免疫原性高。 二、抗原的乳化 乳化的方法：在乳化之前，将抗原用保存在4℃的PBS稀释好，稀释后的浓度为1mg/ml。弗氏佐剂、不完全佐剂与抗原乳化时，弗氏佐剂与稀释后抗原的比例为1：1。 1：PBS的配置:用电子天平称NaCl 0.8g、KCl 0.02g 、Na2HPO4 0.144g、KH2PO4 0.024g、ro水80ml; 加盐酸调节pH 7.2后，定容至100ml.放置在4℃。 2、人IgG的稀释：称取2mg的人IgG于5ml的EP管中，用移液枪移取 1ml PBS将2mg 的人IgG稀释。 牛血清白蛋白的稀释：称取2mg的牛血清白蛋白于5ml的EP管中，用移液枪移取1ml 的PBS将牛血清白蛋白稀释。
多克隆抗体的原理及制作方法 一、原理 多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未 成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。 二、材料 （一）动物选择 根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的
物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没 有明显的损伤。 （二）抗原 制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。对于蛋白质抗原，可以是天然蛋白或变性构 象的蛋白，这主要决定于抗体的用途。比如用于筛选细菌cDNA表达 文库或免疫印迹的抗体，最好用变性蛋白制备抗血清；而筛选真核生物转染系统表达的cDNA产物、或对天然细胞合成的蛋白进行免疫印 迹检测时，最好用天然蛋白质制备的抗血清。需要注意的是，少量的非目标污染物往往比目标免疫原的抗原性更强，所得抗血清对非目标蛋白的活性比对目标蛋白的结合能力更强。 （三）佐剂
多克隆抗体制备 多抗制备通常用抗原免疫动物，激发动物机体免疫系统产生抗体，最后通过获取动物高免血清获得抗体； 获得的高免血清大部分可以直接使用，用于普通免疫学实验，有些则需要机一部纯化修饰才可以使用。 一、动物免疫 动物的免疫是制备抗体最为重要的环节之一，物种选择上最好选择与抗原物种远亲缘动物为宜。下表列出常规抗原在不同动物上的使用剂量和免疫程序。 程序和剂量：以蛋白类抗原为例（一般免疫间隔为3周，如果比较急，也可间隔2周免疫一次） 1.动物的准备及背景测试 选取健康符合实验动物标准的动物，免疫前需要静养一周，免疫前采血进行背景测试。 1.2 兔耳静脉取血方法 耳静脉取2ml血，如果耳静脉不明朗，可擦拭二甲苯，一般来说取1ml以上是足够做背景测试用的。 1.2.1 将兔子固定在固定盒内，轻轻抚摸背部使其安静下来； 1.2.2 用75%酒精棉擦拭兔耳朵，使其耳静脉可见，必要时可用刮刀刮净兔耳上的毛，如果血管依然不明显可用 二甲苯擦拭，使其血管膨胀。 1.2.3 用5ml注射器针头平行插入耳静脉，轻轻回吸（吸的太快，静脉不能及时回血，血管会堵塞针头），血液 缓冲进入注射器管腔。 1.2.4 迅速将注射器中的血液注入离心管，37 ℃放置1h，4 ℃过夜血清析出。 1.2.5 将血清析出的离心管于4 ℃，10,000rpm离心10min，收集上清，即为血清，短期不使用，需加入0.02%NaN3， -20℃保存。 1.3 大小鼠眼眶取血方法 1.3.2 紧握颈部，压迫颈部两侧使眼突出，眶后静脉丛充血。 1.3.3 右手持毛细管从眼内眦（zì）部，与书面成45°夹角旋转刺入。 1.3.4 固定身体，压住后肢，放松手指，调整毛细管，使血流顺畅，离心管接收。 1.3.5 取血完毕，放松颈部压力，拔出毛细管，干棉球按压止血。 1.3.6 离心管，37 ℃放置1h，4 ℃过夜血清析出。 1.3.7 将血清析出的离心管于4 ℃，10,000rpm离心10min，收集上清，即为血清，短期
多克隆抗体制备免疫小鼠 简介 多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。 流程 多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤： 1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原， 可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。 2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠 体内，观察免疫反应情况。 3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清， 获得抗体。 4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试 验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术， 对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。 关键步骤 抗原制备 抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。以下是一些常见的抗原制备方法： •纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。 •重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。 •合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。 适当的佐剂 适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的
活化。常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。 免疫小鼠免疫 将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等 方式将抗原注射到小鼠体内。注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。 血液采集和抗体收集 一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。 抗体筛选和纯化 获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进 行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。筛选出特异性较好的抗体后，可以通过亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α' β' 血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。 3 ．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。 4 ．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕冷，寿命为1 5 年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。 二、选择实验动物的原则 1 ．3R原则3R 指的是reduction（减少）、replacement（替代）和refinement（优化）。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。 2 ．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。 3 ．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。 4 ．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。 三、免疫动物的选择 可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选 择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ- 免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素：（一）动物种系免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间）。实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。
多克隆抗体技术及其制备技术 1.多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。 2.免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不
泰实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
多克隆抗体制备流程 多克隆抗体制备流程有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选 前往丁香实验 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。 抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。 抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤 多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。 具体实验步骤如下： 1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用） 1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静； 1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)； 1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀； 1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)； 1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口； 1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清； 1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。 2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色； 2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。 2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。 3.效价检测 3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
多克隆抗体的应用及现状 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体群体，与单克隆抗体相比具有更强的多样性和高度的特异性。多克隆抗体广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域，成为重要的实验和临床工具。本文将从多克隆抗体的制备、应用以及现状三个方面进行详细介绍。 首先，多克隆抗体的制备是实现其应用的基础。多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：首先，将目标抗原免疫动物（如兔、小鼠等）多次注射，刺激其产生特异性抗体。然后，从动物体内收集血清，分离抗体。接着，将抗体与大量不同的抗原冲突，筛选出特异性较高的抗体克隆。最后，对特异性较高的抗体进行扩增和提纯，得到多克隆抗体。 多克隆抗体的应用广泛涉及多个领域。在生物医学研究中，多克隆抗体常用于蛋白质表达与定位、蛋白质相互作用和信号转导的研究。例如，通过使用多克隆抗体可以检测特定蛋白在细胞内的定位和表达水平，进一步了解其功能及参与的生物过程。此外，多克隆抗体还可以用于免疫组织化学、免疫印迹和流式细胞术等实验技术，以便更全面地研究生物学问题。 在临床诊断中，多克隆抗体也有重要应用。多克隆抗体可以用于特定抗原的定量测定，如肿瘤标志物的测定、感染病原体的检测等。同时，多克隆抗体也可以用于免疫组织化学检测，辅助病理诊断。另外，多克隆抗体还广泛应用于临床病原体的荧光染色和免疫组化检测，用于快速定位和识别病原体，提高诊断效率。
在治疗领域，多克隆抗体已经取得了巨大的成功。多克隆抗体可以用于治疗多种疾病，如癌症、自身免疫疾病等。通过靶向特定抗原，多克隆抗体可以选择性地破坏癌细胞，抑制肿瘤生长和转移。此外，多克隆抗体还可以通过激活免疫系统来增强机体对疾病的免疫反应。近年来，许多多克隆抗体药物已经获得上市和临床使用，成为治疗疾病的重要手段。 然而，多克隆抗体也存在一些局限性和挑战。首先，多克隆抗体制备过程中存在批次差异，导致抗体的特异性和亲和力有一定的波动性。此外，多克隆抗体的批量生产和提纯成本较高，难以大规模应用。为了解决这些问题，近年来，单克隆抗体的发展和应用得到了快速发展。单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的抗体，具有更强的特异性和一致性。单克隆抗体已经成为当前生物医学研究和临床治疗的主流。 综上所述，多克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。随着单克隆抗体技术的不断发展和改进，预计多克隆抗体将逐渐被单克隆抗体所取代。然而，多克隆抗体作为一种重要的研究工具和药物，仍然存在一定的应用空间，并且在某些特定情况下可能仍然是更好的选择。因此，多克隆抗体的研究和应用仍然具有重要意义，在未来仍将继续发展。
免疫抗体和多克隆抗体的制备和应用免疫抗体和多克隆抗体是在生物识别、生物学研究、疾病诊断、治疗和预防等方面广泛应用的研究工具。本文将介绍免疫抗体和 多克隆抗体的制备方法和应用领域。 1. 免疫抗体的制备 免疫抗体是由动物免疫系统产生的抗体，经过分离、纯化和浓 缩制备而成。主要包括单克隆抗体和多克隆抗体。 1.1 单克隆抗体的制备 单克隆抗体是一种高度特异性、亲和力强的免疫抗体，适用于 复杂蛋白质分子的特异性检测和定量分析。其制备主要包括以下 步骤： (1) 免疫原制备：选择纯化后的单个蛋白或多肽作为免疫原， 经过多次免疫小鼠、大鼠或兔子等动物。
(2) 制备淋巴细胞：从免疫动物的脾脏或淋巴结中获得淋巴细胞。 (3) 制备骨髓瘤细胞：从骨髓瘤患者中筛选出与免疫细胞融合的骨髓瘤细胞。 (4) 实现细胞的杂交：以多核融合剂将淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合。 (5) 选择和筛选：细胞融合后，使用一种名为“限制性稀释”法的技术来选择和筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。 (6) 扩增：将杂交瘤扩增到满足免疫抗体生产的数量。 (7) 收集：从生产的杂交瘤中收集单克隆抗体。 1.2 多克隆抗体的制备 多克隆抗体是由多个不同B细胞分泌的免疫抗体组成，在体内能针对不同的抗原位点金标记物。其制备主要包括以下步骤：
(1) 免疫原制备：选择纯化后的单个蛋白或多肽作为免疫原，经过多次免疫小鼠、大鼠或兔子等动物。 (2) 收集血清：收集免疫动物的血清。 (3) 分离抗体：将血清分离抗体，具体过程包括酸性与碱性裂解、硫酸铵法沉淀、Ion交换层析、凝胶过滤等。 (4) 纯化和鉴定：将分离的抗体再纯化，使用SDS-PAGE和Western Blot等方法进行鉴定。 2. 多克隆抗体的应用 多克隆抗体的适用性很广，可以应用于免疫诊断、治疗和治疗等多个领域。 2.1 免疫诊断
小鼠抗体制备 引言： 小鼠抗体制备是生物医学研究中常用的技术之一，它可以通过免疫小鼠来获得特异性抗体。本文将介绍小鼠抗体制备的基本原理、步骤和常见应用。 一、小鼠抗体制备的基本原理 小鼠抗体制备的基本原理是通过免疫小鼠，使其产生特异性抗体。免疫过程中，小鼠的免疫系统会识别并产生抗体来应对免疫原（抗原）。这些抗体可以通过收集小鼠的血液或脾细胞来获取。 二、小鼠抗体制备的步骤 1. 抗原选择：根据研究需要选择合适的抗原。抗原应具有免疫原性，并且能够激发小鼠产生特异性抗体。 2. 免疫小鼠：将抗原与小鼠注射，激活小鼠的免疫系统。通常，第一次注射抗原称为初免，之后的注射称为增强免疫。 3. 收集免疫小鼠的血液或脾细胞：在免疫过程后期，可以通过获取小鼠的血液或脾细胞来收集抗体。 4. 分离抗体：通过一系列的离心、纯化和浓缩步骤，可以从小鼠的血液或脾细胞中分离出抗体。 三、小鼠抗体制备的常见应用 1. 免疫组织化学：小鼠抗体可以用于检测组织中特定的蛋白质或分
子。通过与荧光或酶标记的二抗结合，可以观察到目标分子的分布和表达水平。 2. 免疫印迹（Western blot）：小鼠抗体可以用于检测蛋白质在蛋白印迹中的表达水平。将小鼠抗体与特定蛋白质结合，然后通过次级抗体结合荧光或酶标记物进行可视化。 3. 免疫组化（Immunohistochemistry）：小鼠抗体可以用于检测组织中特定蛋白质的表达。通过与荧光或酶标记的二抗结合，可以观察到目标蛋白质的位置和表达水平。 4. 流式细胞术（Flow cytometry）：小鼠抗体可以用于检测细胞表面的特定蛋白质。通过与荧光标记的二抗结合，可以对不同细胞亚群进行分析。 5. 免疫治疗：小鼠抗体可以用于治疗某些疾病，如癌症。通过结合肿瘤细胞表面的特定抗原，小鼠抗体可以激活免疫系统来攻击肿瘤细胞。 结论： 小鼠抗体制备是一项重要的生物医学研究技术，通过免疫小鼠获得特异性抗体。其原理简单，步骤清晰，广泛应用于免疫组织化学、免疫印迹、免疫组化、流式细胞术和免疫治疗等领域。小鼠抗体制备的发展为生物医学研究提供了重要的工具和方法。
小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆 抗体的制备 【摘要】目的：体外原核表达小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制备多 克隆抗体。方法：从质粒Foxp3��pMD��18T扩增小鼠Foxp3 全长基因，亚克 隆至原核表达载体pET��32a，转化E.coli BL��21； IPTG诱导表达目的蛋 白，Ni2+��NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白；纯化蛋白免疫家兔，制备多克隆 抗体，ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹检测抗体特异性。结果：成功构建了Foxp3��pET��32a原核表达载体，表达和纯化了目的蛋白；ELISA法检测抗体 效价为1∶20 000，蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。 结论：成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。 【关键词】 Foxp3；原核表达；多克隆抗体；小鼠 ［Abstract］ Objective: To prepare rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein by prokaryotic expression of mouse Foxp3 protein in vitro. Methods： Foxp3 gene was amplified by PCR from the full length plasmid Foxp3��pMD��18T and subcloned into the pET��32a vector; the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL��21 and the expression of recombinant protein was induced by IPTG. after purified with Ni2+��NTA column， identification of the recombinant protein by Western blot was performed; the purified protein was used as antigen to immunize rabbits， the titer and the specificity of the rabbit anti��Foxp3 antibody were detected by ELISA and Western blot， respectively. Results： The prokaryotic expression vector for Foxp3��pET��32a was constructed successfully; mouse Foxp3 protein had been expressed and purified; rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein was prepared， the tit er of the antibody was 1∶20 000 by ELISA and Western blot analysis showed that the polyclonal antibody could specifically recognize mouse Foxp3 protein. Conclusion：Mouse Foxp3 protein had been expressed and rabbit anti��Foxp3 antibody had been prepared successfully. ［Key words］ Foxp3; prokaryotic expression; polyclonal antibody; mouse
鼠PrP的无细胞表达及其多克隆抗体的制备 汤鑫;李莎;沈景林;万家余;鞠传静;梁斌斌;李忠义;孟轲音;刘文森;郝镯;栾世慧;张晓晶 【期刊名称】《中国人兽共患病学报》 【年(卷),期】2012(028)004 【摘要】目的成功的表达鼠的PrP,制备特异性的兔抗PrP多克隆抗体.方法以BALB/c小鼠肝脏基因组DNA作为模板运用PCR技术成功扩增了PrP23-231,将其克隆到pRSET原核表达载体中,构建重组表达载体pRSET PrP23-231.将该重组载体进行无细胞表达,然后对成功表达的PrP进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,并进行Western-blot鉴定.结果通过Western-blot鉴定,有约30 kD的目的条带,证明蛋白成功表达,并进行其多克隆抗体的制备并进行Western-blot鉴定,有约30 kD的目的条带,证明成功制备了PrP的多克隆抗体.结论成功表达了PrP23-231,并且成功制备了其多克隆抗体,为进一步研究PrP的功能奠定了基础. 【总页数】4页(P327-329,332) 【作者】汤鑫;李莎;沈景林;万家余;鞠传静;梁斌斌;李忠义;孟轲音;刘文森;郝镯;栾世慧;张晓晶 【作者单位】吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,长春,130122;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,长春,130122;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;军事医学科学院军事兽医研究所,长春,130122;吉林大学第四医院心内科,长春,130000;吉林大学第四医院心内科,长春,130000;军事医学科学院军事兽医研究所,长春,130122;军事医学科学院
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。 免疫佐剂