蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体
的制备方法参考
一、蛋白的原核表达
实验目的
蛋白的原核质粒的构建。
适用范围
蛋白原核表达。
实验原理
参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》
实验试剂
病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒
实验设备和材料
DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞
操作步骤
（一）病毒RNA的提取（Trizol法）
参照分子克隆的方法进行，
（1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。
（2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。
（3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。
（4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。
（5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。
（6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。
（7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。
（8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。
（二）反转录
反应体系（20 μL）：按下列顺序加样
M-MLV Buffer 4 μL
10M dNTPs 1 μL
DEPC 水 3 μL
随机引物 1 μL RNA酶抑制剂 0.5 μL
反转录酶 M-MLV 1 μL
提取的 RNA 9.5 μL
总体积20 μL
反应条件：42℃水浴 1~1.5 h
（三）引物设计与合成
依据新城疫毒株全基因序列，运用Oligo或者Primer Premier5.0软件设计上下游引物，设计引物是注意选择常用的酶切位点以及保护性碱基的添加引物使用前用灭菌超纯水配成相应浓度，-20℃保存备用。
注意：如果扩增片断先连T载体时，则完全没有必要添加保护性碱基；只有当直接对扩增片断进行酶切时，才必须添加，具体数量可参考试剂公司关于该酶切位点的说明）。
引物设计原则：
（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
（3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用连续的碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
（4）引物序列的GC含量一般为40%-60%，过高或过低都不利于引发
反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
（5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。（6）ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5 kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。（8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
（四）目的基因扩增（聚合酶链式反应（PCR））
参照分子克隆的方法进行，加入试剂如下（GenStar高保真酶，不同酶体系不同，具体参照相关酶说明书）
PCR 反应体系（50 μL）：
按下列顺序加样
上游引物0.3~0.5 μL
下游引物0.3~0.5 μL
2×superstar Mix 10 μL
cDNA 1 μL
ddH2O 补齐到总体积
50 μL Total 50 μL
反应程序：
预变性变性退火延伸98℃
98℃
60℃（引物 Tm 值）
72℃
30 s
10 s
20-30 s
30 s
终延伸
30 cycles
72℃10 min 4℃保存
（五）基因克隆及和序列分析
采用生工胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片段，与平模端载体16℃连接过夜，取连接产物转化DH5α感受态细胞，将菌体均匀涂于含抗性的LB固体平板（LB平板中具体加入哪种抗生素要依据不同质粒具有哪种抗性而言）上进行蓝白斑筛选。37℃倒置培养过夜后挑取单个白色菌落进行摇菌和酶切鉴定，对重组质粒进行菌液PCR和双酶切鉴定，鉴定为阳性的菌液送生工或英潍捷基有限责任公司测序。
T4 连接酶连接体系（载体：目的片段=1:7）
载体0.5 μL
目的片段7.5 μL
T4 连接酶 1 μL
T4 buffer 1 μL
Total 10 μL
试剂盒：天根菌液PCR试剂盒
2×Reaction Mix PCR反应体系
（20μl）：按下列顺序加样
上游引物 1 μL
下游引物 1 μL
2×Reaction Mix 10 μL
菌液 1 μL
ddH2O 补齐到总体积 20 μL Total 20 μL
反应程序：
预变性变性退火延伸94℃
94℃
55℃（引物Tm值）
72℃
4 min
10 s
20-30 s
10 min
终延伸
25 cycles
72℃10 min 4℃保存
（六）目的基因蛋白原核表达载体的构建
将构建的克隆载体和目的载体用相同的两个酶进行双酶切，回收克隆载体酶切打来的目的片段以及酶切过的目的载体，用T4连接酶对酶切下来的目的片段和酶切的目的载体链接，采用与上面第5步相同的方法，对进行克隆、测序。
（七）目的基因在大肠杆菌中的原核表达
将重组表达质粒转化BL21细胞，涂布于含有相应抗性LB固体平板上，37℃培养。次日分别挑取单菌落接种于1 mL含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃活化过夜后，按1:100的体积比接种LB液体，待D600 nm 值达到约0.6时，加ITPG 至终浓度1 mmol/L，37℃诱导表达，分别于0、2、4、6 h及诱导过夜时收集菌液各1 mL，用10％分离胶进行SDS-PAGE检测。
（八） Western blotting 分析
SDS-PAGE电泳后，采用半干转膜法将蛋白质转移到NC膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜后，用TBST洗三次，每次5 min。依次加入一抗（鸡AIV阳性血清）、4℃过夜或者37℃1 h。一抗回收后，用TBST洗NC膜，洗3次，每次5 min。避光条件下孵育二抗，
37℃ 1 h。然后用TBST洗三次，每次5 min。用扫膜仪扫膜成像。
二、纯化
实验目的
纯化原核蛋白
适用范围
His标签重组蛋白纯化
实验试剂
（一）Bind buffer：（1 L）
组分：20 mM Na3PO4·12H2O，500 mM NaCl
配制：称量试剂如下
Na3PO4·12H2O：7.59 g
NaCl：29.22 g
将pH调至7.4后，用0.45 μm 滤器过滤。根据后续试验具体情况添加咪唑配制杂蛋白洗脱液。
（二）Elution buffer（1 L）
组分：20 mM Na3PO4·12 H2O，500 mM NaCl，500 mM imidazole （咪唑）配制：称量试剂如下
Na3PO4·12H2O：7.59 g
NaCl：29.22 g
Imidazole: 34 g
将pH调至7.4后，用0.45 μm 滤器过滤。以上试剂室温储存。
实验设备和材料
填料Ni Sepharose TM 6 Fast Flow及纯化柱（GE 公司）。
操作步骤
（一）样品准备
重组表达菌经超声裂解后，10000×g离心10 min，用注射器小心地吸取上清液，用0.45 μm滤器过滤备用。（如无需立即纯化，可暂存于-80 度冰箱）
（二）装柱
取填料2 mL加入纯化柱中，用超纯水洗5遍，除去储存液中的酒精，每次7 mL.
（三）结合
用Bind buffer洗3遍，每次7 mL，平衡柱子。
吸取7 mL样品加入柱中，回收滤过液，堵住下口，将滤过液重新
加入到柱中，堵住上口，温和的颠倒混匀，使填料均匀重悬，4℃垂
直静置30 min（此处可延长时间）。打开上下柱口，将滤过液再次
过滤。滤过液取样备用。用Bind buffer洗5次，每次4 mL。
（四）梯度洗脱
吸取2 mL 20 mM咪唑洗脱液（向Bind buffer中添加咪唑即可制备）加入柱中，弃掉滤过液，再次加入2 mL后收集滤过液备用。用2 mL
20 mM 咪唑洗脱液再洗，直至OD280（用该浓度洗脱液作为空白调零）变为0，收集滤液。用同样的方法，依次用浓度为100 mM，150 mM，200 mM咪唑的洗脱液咪唑洗脱液，收集滤液备用。最后用Elution buffer洗脱至OD280变为0，测定滤液浓度并做好标记（标记内容包括
洗脱液浓度，管号，日期和滤过液浓度）。
（五）洗柱及保存
用Bind buffer清洗柱子，每次7 mL，清洗5次。加入2 mL Bind buffer 将柱子储存于4℃冰箱。（如需长期储存，则用20%的乙醇储存于4℃）
（六）电泳检测纯化情况
选取各浓度洗脱的蛋白中浓度最高的那管，加入loading buffer 后煮沸10 min，进行电泳。电泳后用考马斯亮蓝染色液对蛋白胶染色30 min，用脱色液脱色后，比对各浓度洗脱液洗脱后蛋白条带的差异，选取洗脱杂蛋白较多而目的蛋白较少的浓度作为杂蛋白洗脱浓度（也可直接作为结合液使用）。选取目的蛋白完全洗脱的浓度作为最终的洗脱浓度（也可直接选用Elution buffer）。
注意事项
1、整个过程低温进行效果更佳，纯化应一气呵成，不要分成两天做。
2、如果没有目的条带，有可能未表达成功，也有可能是未结合或Bind buffer与Elution buffer混用，应将上清原液和滤过液一起跑胶，检测表达与结合情况。
3、如果选用的洗脱液梯度不能满足实验需要，可进一步细化洗脱梯度，合适的杂蛋白和目的蛋白洗脱浓度。
4、建议纯化之前菌液进行大摇，每个菌摇2L备用，并在纯化前检验表达情况，未用完的蛋白-80 度储存。
5、镍柱可以回收再利用，具体方法见Ni SepharoseTM 6 Fast Flow试剂说明。
三、多克隆抗体制备
实验目的
制备兔多克隆抗体。
适用范围
病毒蛋白兔多克隆抗体制备。
实验试剂
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（sigma公司）。
实验材料
实验动物：普通级新西兰兔（广东省医学实验动物中心），雌性，2-3只；50 mL超滤管（Milipore公司）、另需震荡器、1 mL注射器、静脉采血针（小）等。
操作步骤
（一）蛋白浓缩与乳化
将蛋白纯化液加入超滤管中（超滤管预冷），4000×g 4℃离心10 min，测定蛋白浓度，如蛋白浓度不到1 mg/mL，则继续加纯化液再次离心，直到浓缩至所需浓度。取总量为3-4 mg蛋白浓缩液与等量佐剂混匀，剧烈震荡40 min，吸取样品滴入水中，静置不分散，则乳化成功，否则继续震荡至乳化完全。
（二）免疫程序
背部皮下多点注射免疫新西兰白兔，每次注射蛋白1-2 mg/只。首免使用完全佐剂乳化后蛋白，首免后第21天，使用弗氏不完全佐剂乳化蛋白进行二次免疫，第28天使用弗氏不完全佐剂乳化蛋白加强免疫一次，第35天时使用弗氏不完全佐剂乳化蛋白进行四免，第42天，将兔保定后，心脏采血，37℃静置1 h，再4℃放置过夜析出血清，5000 rpm/min，5 min。取上清，少量分装，于-20℃保存。每次免疫前均用静脉采血针采血2 mL，析出血清备用。
（三）用ELISA方法检测血清中抗体效价。
注意事项
1、理论上每只兔子抗原量1 mg就足够了，但是由于乳化后管壁上会残留大量蛋白，因此乳化要过量，免疫时尽量少量多点注射，避免吸收不完全。
2、首次使用完全佐剂有利于诱导机体识别和捕捉抗原，因此选用弗氏完全佐剂。由于免疫记忆现象的存在，再免时无需继续使用完全佐剂。
3、心脏采血时，一定要将兔子保定好，建议两个人一组保定，采血后务必使用15 mL离心管采集（实验证明，50 mL离心管更易出现溶血现象）。
4、析出血清后，应尽快分装冻存，取少量进行效价测定。
pGEX-4T-3- pMD19-T-S11原核表达载体的构建、表达与纯化 及多克隆抗体的制备 水生呼肠孤病毒是水域生态环境中广泛存在的一类病毒，其中草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是在1991年被国际病毒分类委员会(ICTV)分到水生呼肠孤病毒属，是由中国分离鉴定的第一株鱼类病毒[1]。GCRV是具有双层衣壳、无囊膜、立体对称的20面体球形颗粒，主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量以糖蛋白的形式存在的糖类，不含脂类[2]。草鱼自古以来就是中国池塘养殖的当家品种，而GCRV被认为是水生病毒中对草鱼毒力最强、致病死亡率最高的病毒之一，该病毒引起的出血病不仅直接危害鱼体，而且会激发细菌性“三病”的发生，使草鱼的成活率降低到40~50[3]，甚至只有10%左右[4]，给中国的草鱼养殖业造成了很大的危害和困扰。草鱼病毒性出血病，主要侵染于草鱼心脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾、鳃、肠道等组织，且化学药物很难达到治疗效果，为了给草鱼养殖增产和减小不必要的经济损失，找到有效防治GCRV 的方法显得尤为重要。 GCRV基因组含有11条双链RNA(dsRNA)，其分段基因组RNA的3' 端不含poly(A)尾巴, 在5’和3’末端各含有特异的重复保守序列，为5’-GUUAUU和3’-UCAUC。11个片段根据凝胶电泳迁移率可分为3组，即大片段(L1,L2,L3)、中等片断(M4,M5,M6)、较小片段(S7,S8,S9,S10,S11)。GCRV共编码5 种非结构蛋白, 分别是NS16、NS26、NS31、NS38、NS80[5]。病毒的非结构蛋白在病毒的复制过程中发挥重要作用。其中NS26是由S11编码的，含有244个氨基酸残基，分子量为26.4KD, 是水生呼肠孤病毒特有的蛋白质, 没有同源蛋白，含ATP-依赖性的RNA解螺旋酶功能性位点[6]。 国际上对GCRV编码蛋白的功能(尤其是非结构蛋白的功能)方面的研究还不够系统和全面；但根据呼肠孤病毒家族中同源蛋白功能相似的原则，除非结构蛋白NS26外，GCRV各蛋白在病毒复制周期中的地位和作用已经初步明确[7]。因此，研究S11表达的非结构蛋白NS26的免疫原性，并对其多克隆抗体进行分析，以期为今后研制草鱼亚单位疫苗做好坚实铺垫。 课题组从草鱼养殖场患出血病的病鱼体中分离到一株具强致病力的病毒株，命名为GCRV-GD108[8]。本研究采用基因工程的方法，从感染GCRV-GD108的草鱼肾脏细胞CIK中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR扩增了S11基因，通过TA克隆连接至载体pMD-19-T中，构建了重组载体pMD-19-T-S11，再将重组载体pMD-19-T-S11双酶切连接至表达载体pGEX-4T-3，构建了重组表达质粒，酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒在大肠杆菌BL-21中进行高效表达，用IPTG诱导获得了可溶性重组蛋白，采用GST亲和层析和凝胶过滤层析的方法对重组蛋白进行纯化，获得融合蛋白，利用SDS-PAGE及Western blotting检验融合蛋白。采用纯化后的含有GST的融合蛋白免疫日本长耳大白兔制备多克隆抗体，ELISA法测定血清抗体的效价。 1.1实验材科与实验仪器 1.1.1菌株、质粒和细胞 草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108，感受态细菌DH5α和BL-21，原核表达载体pGEX-4T-3和pMD-19-T，草鱼肾脏细胞（CIK）为本实验室保存。 1.1.2实验试剂 DNA限制性内切(Bam H I和XhoⅠ)，Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Fragment Purification Kit，DNA Marker和Agarose Gel DNA Purification Kit，低分子量蛋白Marker和异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG)购自大连TaKaRa生物工程有限公司。Turbo Script逆转录第一链cDNA合成试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司；GSTrap 亲和柱购于GE Healthcare公司；还原型谷胱甘肽为Merck公司分装；PCR引物合成和
蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体 的制备方法参考 一、蛋白的原核表达 实验目的 蛋白的原核质粒的构建。 适用范围 蛋白原核表达。 实验原理 参考实验室工具书《分子克隆实验指南》《抗体制备与使用实验指南》 实验试剂 病毒RNA的提取（Trizol法）相关试剂，反转录相关试剂（M-MLV Buffer、10M dNTPs、DEPC水、随机引物、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV），GenStar高保真酶，T4连接酶，菌液PCR相关试剂，Western blot试剂盒 实验设备和材料
DH5a感受态细胞、BL21感受态细胞 操作步骤 （一）病毒RNA的提取（Trizol法） 参照分子克隆的方法进行， （1）将250 μL液体样品加入1.5 mL Ep 管中，再加入750 μL冰预冷的TRIZOL。 （2）将样品剧烈混合后，在室温静置5 min。 （3）加入200 μL氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和，使液体充分混匀呈乳白状（无分相现象）后，再室温静置5 min。 （4）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min。 （5）将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇并上下颠倒混匀，然后在室温静置至少 10min。 （6）在4℃条件下，以12000×g 离心15 min 后，小心并尽可能地去除全部上清液。 （7）用1 mL 75% DEPC 乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁，4℃ 12000×g离心5 min后小心弃去乙醇。 （8）将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用 10μL 无 DEPC 水（无RNA酶的水）将RNA溶解并于-20℃保存。 （二）反转录 反应体系（20 μL）：按下列顺序加样 M-MLV Buffer 4 μL 10M dNTPs 1 μL DEPC 水 3 μL
原核表达及纯化-His tag 一、原核表达 1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素 抗性）。37℃，过夜摇菌。 2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6 时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白） 200μL做SDS-PAGE） 3.收菌： (1)200μL诱导后全菌； (2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别 收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。 大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。 二、可溶性分析 目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。根据这个结果选择纯化方法。 （1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）； 用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀； （2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀； （3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer； （4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。 （5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。 三、小量富集实验 样品制备：
取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE） 富集： 1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。 2.平衡：向离心管中加200μL 1×Binding Buffer（8M Urea），混匀1min，700g 离心1min，去上清；重复一次。 3.上样：将制备的上清蛋白加到离心管中，混匀30min（混匀仪上）。700g离 心1min，上清即为穿透（留样做SDS-PAGE）。 4.淋洗： 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，5mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，10mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，20mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 5.洗脱： 加50μL 1×Elution Buffer（8M Urea，50mM咪唑），混匀，700g离心1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 加50μL 1×Binding Buffer（8M Urea，3000mM咪唑），混匀，700g离心 1min，分离上清，留样做SDS-PAGE； 6.取少量柱料做SDS-PAGE； 注：用定量工作液估计蛋白的浓度：2μL待测蛋白溶液+180μL定量工作 液，根据颜色的变化可以估计蛋白的浓度。对富集过程进行监控。 四、大量富集实验 样品制备：用50mL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解菌体，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）或者用高压破碎仪（推荐）。4℃，19000g 离心15min，取上清用于富集实验。（留样做SDS-PAGE） 富集： 1.装柱：将1mL Ni柱料装入层析柱，用至少三个柱体积的超纯水以工作流速 （每滴/3S）压实柱料，以获得均一的柱床，同时避免带入气泡。
多克隆抗体的制备 1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。 表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。超声后10000r/min离心5min，沉淀用500μl PBS悬起，后加入400μl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100μl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。将500μl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500μl 样品）。 凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。纯化蛋白置于4℃短暂保存。 2.蛋白复性 将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。更换复性液，4℃作用2h。再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。如蛋白浓度未满足免疫浓度，可将透析袋中复性后的蛋白置于50% PEG8000溶液中进行浓缩。 3.蛋白乳化 将蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(首免)/不完全弗氏佐剂混合，用注射器来回吹打，乳化2-3h。乳化效果的检测：在水中加入一滴上述乳化液，当乳化效果良好时，液滴就聚集在一起; 如果液滴分散开来，说明乳化不完全，继续乳化，直到理想的乳化液形成为止。 4.免疫程序 多选用健康成年家兔进行免疫。新购买的家兔饲养4-5d后无异常可进行免疫。免疫接种前先采集血样，留作后续试验使用。 采用脊椎两侧背部皮下多点注射接种，每点可注入0.5ml。第一次免疫（参考剂量：2mg）后2周进行第二次免疫，第二次免疫剂量为首免的一半（1mg）。二免3-4d后可耳缘静脉采血1ml，进行血清效价检测。二免后进行第三次免疫，剂量同二免。三免3-4d后可进行血清效价检测，直到血清效价达到要求后，可进行加强免疫（剂量同前，应用PBS代替弗氏佐剂与蛋白混合），大约一周后行颈静脉放血，收集血清。 5.血清效价检测 应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中抗体水平。 a.用包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液配方：碳酸氢钠2.93g；碳酸钠1.5g pH 9.6）将纯化 后的蛋白稀释为终浓度1-10μg /ml，100μl/孔，4℃包被过夜。 b.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。5%脱脂乳（PBS配制）37℃封闭2小时，200μl/ 孔。 c.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。加入PBS稀释好的一抗（待检血清），100μl/孔； 设阴性血清对照。置于37℃作用1h。 d.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。加入HRP标记的二抗1：5000稀释，100μl/孔，置
截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达、多克隆抗体的制备和鉴定 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的: 构建截短型鸭乙型肝炎病毒（DHBV）核心蛋白的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达, 制备多克隆抗体。方法: 应用基因工程技术将编码截短型DHBV核心蛋白(DHBcAg 1～214aa) 的基因片段装入原核表达载体pRSET B 内, 在宿主菌Rosetta(DE3) pLacI 内进行诱导表达, 运用Ni NTA方法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体, 并采用酶联免疫吸附实验(ELISA), Western blot及免疫组化检测抗体的灵敏度和特异性。结果: 成功地构建了含截短型DHBV核心区基因的质粒, 并纯化得到了相对分子质量(Mr)约为28 000的目的蛋白, 用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体。结论: 获得的重组截短型DHBV核心抗原纯度高, 免疫反应性强; 获得的多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性, 为DHBV的检测和研究奠定了实验基础。 【关键词】鸭乙型肝炎病毒核心蛋白原核表达载体多克隆抗体
鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus, DHBV)与人乙型肝炎病毒(HBV)同属嗜肝DNA病毒科, 被广泛用于研究嗜肝DNA 病毒的复制机制、细胞表面病毒受体、病毒清除机制和筛选新的抗病毒药物的动物模型。DHBV主要编码外膜蛋白、核心蛋白和P蛋白, 其中核心蛋白(DHBcAg)分子约262个氨基酸,其氨基端有装配核心颗粒, 羧基端有结合核酸的功能[1]。最近研究中, Thermet等[2]通过对DHBcAg和HBcAg抗原决定区（AR）的比对, 得出DHBcAg AR5与HBcAg AR2相似的结论, 并结合文献报道HBcAg按其功能的不同大致可分为装配区(1～144aa)和核酸结合区(145～183/185aa)[3]。本研究中我们将DHBcAg从AR5后的214位氨基酸截取, 构建截短型DHBV核心蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中表达, 制备多克隆抗体。 1 材料和方法 1.1 材料 限制性内切酶Xho I、Pst I、T4 DNA连接酶、LA Taq 酶、蛋白marker、DL 2000购自TaKaRa公司。Ni NTA Spin Column kit 购自德国Qiagen公司。鼠抗His单克隆抗体（mAb）和HRP标记羊抗鼠IgG为美国Santa Cruz公司产品。GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder购自立陶宛MBI公司。异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）购自美国Promega公司。Western blot试剂盒购自Pierce 公司。DYY5型双稳定时电泳仪、DYCZ24D型迷双垂直电泳槽及
小鼠Foxp3蛋白的原核表达及多克隆 抗体的制备 【摘要】目的：体外原核表达小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制备多 克隆抗体。方法：从质粒Foxp3��pMD��18T扩增小鼠Foxp3 全长基因，亚克 隆至原核表达载体pET��32a，转化E.coli BL��21； IPTG诱导表达目的蛋 白，Ni2+��NTA柱纯化及蛋白质印迹鉴定蛋白；纯化蛋白免疫家兔，制备多克隆 抗体，ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹检测抗体特异性。结果：成功构建了Foxp3��pET��32a原核表达载体，表达和纯化了目的蛋白；ELISA法检测抗体 效价为1∶20 000，蛋白质印迹检测结果显示抗体特异性与小鼠Foxp3蛋白结合。 结论：成功表达小鼠Foxp3蛋白并制备了多克隆抗体。 【关键词】 Foxp3；原核表达；多克隆抗体；小鼠 ［Abstract］ Objective: To prepare rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein by prokaryotic expression of mouse Foxp3 protein in vitro. Methods： Foxp3 gene was amplified by PCR from the full length plasmid Foxp3��pMD��18T and subcloned into the pET��32a vector; the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL��21 and the expression of recombinant protein was induced by IPTG. after purified with Ni2+��NTA column， identification of the recombinant protein by Western blot was performed; the purified protein was used as antigen to immunize rabbits， the titer and the specificity of the rabbit anti��Foxp3 antibody were detected by ELISA and Western blot， respectively. Results： The prokaryotic expression vector for Foxp3��pET��32a was constructed successfully; mouse Foxp3 protein had been expressed and purified; rabbit polyclonal antibody against mouse Foxp3 protein was prepared， the tit er of the antibody was 1∶20 000 by ELISA and Western blot analysis showed that the polyclonal antibody could specifically recognize mouse Foxp3 protein. Conclusion：Mouse Foxp3 protein had been expressed and rabbit anti��Foxp3 antibody had been prepared successfully. ［Key words］ Foxp3; prokaryotic expression; polyclonal antibody; mouse
蛋白原核表达纯化原理 蛋白原核表达纯化是一种常用的生物技术方法，用于大量制备目标蛋白质。该方法可以在原核细胞中直接表达目标蛋白，然后通过一系列的纯化步骤获得高纯度的蛋白质样品。以下将详细介绍蛋白原核表达纯化的原理和步骤。 蛋白原核表达纯化的原理主要基于细菌细胞的生物特性。在表达过程中，目标蛋白的基因会被插入到表达载体中，该载体会被转化到细菌细胞中。转化后的细菌细胞会利用其自身的代谢机制表达目标蛋白。 蛋白原核表达纯化的步骤主要包括以下几个方面： 第一步，构建表达载体。在这一步骤中，目标蛋白的基因会被插入到表达载体的多克隆位点中。这个过程可以通过PCR扩增目标基因，然后将其连接到表达载体上。 第二步，转化细菌细胞。在这一步骤中，经过构建的表达载体会被转化到细菌细胞中。转化可以使用化学方法或电穿孔等物理方法进行。 第三步，培养表达菌株。转化后的细菌细胞会被培养在含有适当抗生素的培养基中。培养的条件包括温度、pH值、搅拌速度等，这些条件可以根据目标蛋白的特性进行优化。
第四步，诱导表达。在菌株达到一定的生长密度后，可以通过添加适当的诱导剂来诱导目标蛋白的表达。诱导剂的选择可以根据目标蛋白的特性进行优化。 第五步，收获细胞。在表达过程中，细菌细胞会合成大量的目标蛋白。可以通过离心等方法，将细菌细胞从培养基中收获下来。 第六步，裂解细胞。收获的细菌细胞需要被裂解，以释放目标蛋白。常用的方法包括超声波、高压等物理方法，以及酶解等化学方法。 第七步，纯化目标蛋白。裂解后的混合物中含有大量的杂质，需要通过一系列的纯化步骤来获得高纯度的目标蛋白。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。 经过以上步骤，蛋白原核表达纯化的过程就完成了。这种方法可以高效地制备目标蛋白，并且可以根据需要进行优化。蛋白原核表达纯化在生物医药、生物工程等领域有着广泛的应用前景，对于研究目标蛋白的结构和功能具有重要意义。
低密度脂蛋白受体蛋白的表达、纯化及抗体制备低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)是由低密度脂蛋白受体基因编码的一种跨膜糖蛋白,属于低密度脂蛋白受体家族的一员。细胞可通过LDLR介导低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)内吞来获得外源胆固醇。因此LDLR在调节血液中胆固醇的含量方面具有重要的作用。 LDLR突变或功能缺失是导致正常机体血液中胆固醇含量升高的重要原因,机体中胆固醇的代谢紊乱会导致一系列严重的疾病,例如心血管疾病、动脉粥样硬化和胆结石等。有证据表明肥胖症、糖尿病和阿尔海默氏病(Alzheimer’s Disease)也与胆固醇代谢的紊乱有关。在研究这些疾病详细发病机理的过程中,通常需要检测细胞中LDLR的含量变化,因此制备出高效的LDLR抗体就变得非常的有意义。 本实验以pmLDLR-5×Myc质粒中的鼠源LDLR基因为模板,经过PCR扩增后得到LDLR-C(813-862aa)基因片段,克隆于蛋白表达载体pGEX-6P-1中,得到重组质粒pGEX-6P-1-LDLR-C,并将其转化到大肠杆菌BL21细胞中,经过IPTG诱导表达,得到了带有GST标签分子量大小约为32 KD的LDLR抗原蛋白。表达产物经纯化和定量分析之后免疫新西兰大白兔,收集血清进行抗体特异性检测。结果显示,成功构建了 LDLR-C融合基因的原核表达质粒,获得了 LDLR抗原蛋白,以此蛋白免疫动物可产生特异性强的抗体。 再经过亲和纯化,将抗体进行免疫荧光检测,最终实验结果表明LDLR多克隆抗体的制备是成功的,纯化后的抗体可以用来进行Western Blot实验以及免疫荧光实验。LDLR多克隆抗体成功的制备,为今后LDLR的表达分布检测、细胞内定位及与其它蛋白质间相互作用等许多研究工作的开展奠定了基础。
拟南芥ERA―1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 ERA（Eecherichia coli ras-like protein，简称ERA）基因最早在大肠杆菌中发现，因其蛋白序列与真核生物的大鼠肉瘤（Ras）蛋白相似度高，所以命名为ERA[1]。但随后的研究表明，ERA与Ras蛋白序列相似性主要集中于N端的GTP酶结构域，而其C端与包括Ras在内的其他小GTP酶不具有同源性，因而把它列为一类新的小GTP酶。对大肠杆菌ERA功能的研究表明，该基因是大肠杆菌生存繁殖所必需的[2]。大肠杆菌ERA表达量降低突变体表现为细胞分裂异常、细胞增长呈丝状、拟核数目增多，表明ERA在染色体分离后，胞质分裂前发挥重要作用[3-4]。另有研究表明，ERA的C端能与核糖体16S RNA结合，对核糖体小亚基的组装成熟起重要作用[5-6]。细菌的ERA蛋白序列具有高度保守性，不同种类细菌的ERA蛋白可以互补大肠杆菌ERA的功能[7-8]。 真核生物的ERA基因起源于原核生物，真核生物的ERA蛋白序列?c原核生物具有高度相似性，大多分布于线粒体或叶绿体中[9]。人类ERA同源蛋白ERAL1定位于线粒体[10]，能与线粒体12S rRNA结合，参与核糖体小亚基的组装[11]。ERAL1功能缺陷细胞从G1期进入到S期受阻，进而引发细胞凋亡[12]。拟南芥ERA家族有2个成员ERA-1及ERA-2，亚细胞定位研究表明ERA-1定位于叶绿体，而ERA-2定位于线粒体[13]。目前植物中
ERA的功能尚未见报道，为了方便研究ERA-1在拟南芥叶绿体中的功能，将拟南芥ERA-1基因在大肠杆菌中表达，获得重组ERA-1蛋白经过纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。ERA-1多克隆抗体的成功制备，为后续研究ERA-1的生物学功能提供了条件。 1材料与方法 1.1材料 野生型拟南芥、era-1-1纯合突变体、ERA-1过表达株系（ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5）均为Columbia-0生态型背景，由笔者所在实验室保存。 试验中使用的限制性内切酶、T4连接酶等各种酶类均购自TaKaRa。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等购自天根生化科技（北京）XX公司。His标签蛋白纯化柱填料Ni琼脂糖凝胶6 Fast Flow购自GE Healthcare Life Science。完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为Sigma公司产品；HRP标记的羊抗兔抗体G&R购自北京康为世纪生物科技XX公司；蛋白免疫印迹化学发光试剂盒购自Bio-Rad。其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。 pBluescript-ERA-1为包含ERA-1基因编码区全长序列的重组质粒，该质粒及原核表达载体pET28a、大肠杆菌Top10感受态细胞和BL21（DE3）菌株均由笔者所在实验室保存。 1.2方法 1.2.1原核表达载体的构建以质粒pBluescript-ERA-1为模板，设计引物F1、R1，PCR扩增ERA-1除去叶绿体定位信号肽序
原核表达步骤总结 原核表达步骤总结 原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21 等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 一( 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 制样 (一) 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp o(100mg/mL)，37C200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1:50比例(200ul)，将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中， o加入10uLAmp(100mg/ml)，37C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK)，其余 ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l)，使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。7ml菌液加入7 o以200r/min的转速，37C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dHO，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心 2min，2
倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 (二)菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100?恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。 (三) SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度 (%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12 15-100 10 25-200 8 分离胶(两块)配方 15% 12% 8% ddHO 3.4ml 4.9ml 6.9ml 2 30% Acr-Bis (29:1) 7.5ml 6.0ml 4.0ml 1.5M Tris-HCl( pH8.8) 3.8ml 3.8ml 3.8ml 10%SDS 150ul 150ul 150ul 10%过硫酸铵 150ul 150ul 150ul TEMED 20ul 20ul 20ul 总体积 15ml 15ml 15ml 按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加 7ml溶液。加完后，用1mLddHO封住分离胶液面，在室温(37?)
拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制 备 王玥;梁爽;梁慧珂;郁飞;齐亚飞 【摘要】[目的]将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化,并免疫家兔,获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体,为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证.[方法]将编码拟南芥PAC蛋白的eDNA克隆至原核表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化,并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔,利用分离得到的抗血清,针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACo的总蛋白进行免疫印迹检测.[结果]成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC,在37℃、1 mmol/L IPTG诱导4h的大肠杆菌细胞中,可检测到分子质量为38.9 ku的重组蛋白,其大部分以可溶形式存在.用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清,该抗血清能够有效地检测出1 ng 原核表达的PAC重组蛋白,并在植物样品中检测出1条分子质量约为35 ku的条带.[结论]成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体,可用于植物中PAC蛋白含量的检测.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2016(044)010 【总页数】5页(P171-175) 【关键词】叶绿体;PAC蛋白;原核表达;抗体制备 【作者】王玥;梁爽;梁慧珂;郁飞;齐亚飞
【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西杨凌712100 【正文语种】中文 【中图分类】Q78 在高等植物中，叶绿体是进行光合作用的细胞器，同时还是合成氨基酸、脂类和植物激素等重要代谢物的场所[1]。叶绿体由前质体转化而来，整个发育过程受遗传、环境等因子的紧密调控[2]。当参与叶绿体发育的必需基因功能完全丧失时，植物 通常会表现出白化致死的表型[3]。PALE CRESS(PAC)是参与叶绿体早期发育过程的必需基因。目前报道的拟南芥PAC缺失突变体pac-1和pac-2均白化致死[4-6]，导致关于PAC的功能研究积累很少。PAC缺失导致叶绿体发育受阻，但并不影响核基因RbcS和LhcB的表达。虽然PAC缺失突变体叶绿体的mRNA成熟和积累异常[7]，但是该异常也可能是叶绿体发育受阻而产生的次级效应。蛋白质结 构分析表明，PAC是一个富含α-螺旋的酸性蛋白，没有可辨识的功能域，但酸性蛋白富含负电荷的结构域，通常参与蛋白间相互作用的调控[8]。本研究对PAC蛋白进行原核表达和纯化，制备特异性的多克隆抗体，并对制备的多克隆抗体进行免疫印迹检测，以期为后续从蛋白水平上研究PAC的生物学功能提供条件。 1.1 材料 1.1.1 植株、细菌和载体野生型拟南芥植株(Col-0)、pac-1 (SALK_012320)和CaMV 35S启动子调控的PAC过表达材料(PACOE)，由西北农林科技大学生命科
蛋白表达及抗体制备流程图
具体实验步骤 （一）蛋白原核表达载体的构建 蛋白原核表达载体一般带有His or GST 接头。构建载体时要确保读码框的正确。 （二）重组质粒转入蛋白表达菌株BL21 or ER2566 转化方法同常规转化。 （三）转化菌株的小量诱导表达 (1) 从转化的平板中挑取单菌落，接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜； （2）取100μl过夜培养的菌液接种于2mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振 达到0.6-0.8； 荡培养50min左右，使 OD 600 (3) 加入IPTG至0.5mM，37℃诱导培养4 h；(注意设置不加IPTG的对照；一 般诱导条件为37℃诱导培养4 h，但根据蛋白的不同，诱导温度和时间会有所不同)； (4) 取1mL菌液，12000rpm离心10min，收集菌体； (5) 用100μL PBS悬浮菌体菌体，加入20μL 6×SDS凝胶加样缓冲液，100℃ 沸水浴10 min； (6) 12000rpm离心10 min，取菌体裂解液上清进行SDS-PAGE。 （if经诱导的菌株有目的蛋白表达，则继续如下操作） （7）以相同条件诱导并收集菌体（方法见1-4）； （8）加入200μL PBS悬浮菌体； （9）将浑浊的菌体悬浮液超声至变清(注意冰上操作)； （10）12000rpm离心10min，取上清至另一干净EP管，即为上清管 （11）余下沉淀用100μL PBS悬浮，即为沉淀管（包涵体）； （12）分别向上清管和沉淀管中加入6×SDS凝胶加样缓冲液，100℃沸水浴10 min； （13）12000rpm离心10 min，取上清管和沉淀管的上清进行SDS-PAGE。 （if蛋白在上清或沉淀中有特异表达，则继续进行大量诱导表达）
猪瘟病毒 E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 贾俊杰;张必凯;张莉;谢金鑫;郭焕成;龚文杰;涂长春 【摘要】为表达猪瘟病毒 E0蛋白并制备其多克隆抗体，本研究构建 E0蛋白的原核表达载体，转化至BL21（DE3）菌株，IPTG 诱导表达，亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE 和 Western blot 分析显示 E0重组蛋白主要以包涵体形式表达，亲和层析纯化获得了 E0重组蛋白，用其免疫 Balb／c 小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接 ELISA 显示，免疫小鼠血清中 E0蛋白抗体效价为1∶50000。获得的 E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及 E0-EGFP 融合表达细胞中天然结构的 E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的 E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究 E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。%To express E0 protein of CSFV and prepare its polyclonal antibodies (pAb),the recombinant E0 protein of CSFV Shimen strain was expressed in E.coli BL21(DE3)with IPTG induction and successively purified by affinity chromatography and gel slice.Balb/c mice were immunized four times with the purified recombinant E0 protein.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that recombinant protein was ex-pressed mainly in the inclusion body.The indirect ELISA showed that the antibody titers in the serum of immunized mice was at 1:50000.Moreover,the obtained anti-E0 pAb can specifically react with the E0 pro-tein expressed in virus-infected cells and E0-EGFP-expressing cells.The obtained E0 protein and its poly-clonal antibodies in this study will be useful for future studies on the function and immunogenicity of CSFV E0 protein.
H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制 备 王晓丽;毕振威;王永山;潘群兴;欧阳伟;夏兴霞;诸玉梅 【摘要】将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV) A/Canine/Nanjing/11/2012 (H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析.结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 kDa,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应.将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价.本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据.%The nucleoprotein (NP) gene of H3N2 subtype Canine influenza virus (CIV) A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2) isolated from Nanjing,China,was cloned into pET-28a(+) for generation of a recombinant plasmid pET-NE The resulting recombinant pET-NP was then transformed into E.coli Rosetta(DE3) competent cells following by induction with IPTG.The expression of the NP protein was detected in SDS-PAGE and Western blot.The results showed that the recombinant NP was 61 kDa protein corresponding to the expected molecular mass and reacted with the antiserum against H3N2 subtype CIV.The recombinant NP of CIV was purified via Ni-NTA affinity chromatography and the polyclonal antibodies were produced by immunizing rabbits with purified recombinant
莱茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表达、纯化及多克隆抗体的 制备 田伟;董彬;李镇芳;孟德梅;樊振川 【摘要】IFT139 is a key component of the intraflagellar transport(IFT)complex A in Chlamydomonas reinhard- tii.Mutations,deletions or silence ofift139 gene can affect cilia assembly and depolymerization,and thus lead to ciliopa-thy.To further investigate the role of IFT139 in ciliogenesis,ift139 5′-458 bp EST cDNA fragment was firstly amplified and the recombined plasmids pMAL-c2-ift139 and pET-28a(+)-ift139 were constructed and transferred intoEscherichia coli BL21(DE3).Under IPTG induction,fusion proteins MBP-IFT139 and HIS- IFT139 with a molecular weight of 6.0×104and 2.5×104,respectively,were obtained.The fusion protein MBP-IFT139 was purified by affinity adsorption purification(more than 95%, purity)and then used for immunizing New Zealand white rabbits to produce antiserum.When the titer of antiserum reached 256,000,it was purified by Protein A,and then affinity adsorption purification was followed by nitrocellulose mem-brane purification procedure.The specificity of polyclonal antibodies was evaluated with Western blot.The result showed that the polyclonal antibody can specifically recognize IFT139.The research has provided an important tool for further clari-fying the role of IFT139 in ciliogenesis and cilipathy.%IFT139是莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纤毛内运输蛋白IFT复合物A中的一个重要组分．其编码基因的突变、缺失或沉默将会影响纤毛正