琼脂扩散实验检测抗血清效价
1.称取1.0g琼脂糖融解在100ml PBS(pH7.4)货0.85%生理盐水中，加热融化。
2.将琼脂糖趁热倒在干净的玻片或平皿上，琼脂厚度约3mm。
3.待其冷却后，在其上按照梅花形排布打出直径3～5mm小孔，并挑出孔中琼脂。
4.在火焰上缓缓加热，使孔底部边缘稍融化，以封底，放置加样后漏液。
5.在中间孔加入1mg/ml的抗原，加满不要溢出到其他孔。
6.周边孔分别加入用生理盐水依次倍比稀释的抗血清。
7.加好后将玻片或平皿放入湿盒置于37℃孵育过夜。
8.次日取出，在散射光下，出现沉淀带的血清最高稀释倍数即为此琼扩效价。（如下图）
小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备及检测&豚鼠超敏实验实验报告 实验一：小鼠抗绵羊红细胞抗体的制备及检测 【实验原理】： 一、小鼠抗绵羊红细胞抗体（多克隆抗体）的制备： 特异性体液免疫应答中，抗原可刺激机体产生特异性抗体。每个抗原分子表面常带有多种不同的抗原决定簇（表位），可被机体内不同特异性的B细胞克隆识别并产生不同特异性的抗体。因此以抗原免疫动物所产生的免疫血清实际上是针对该抗原表面不同表位的多种抗体的混合物，又称为多克隆抗体。 用纯化抗原免疫动物是制备多克隆抗体的常用方法。免疫血清的效价和特异性主要取决于抗原和实验动物两方面的因素。欲获得高效价的免疫血清，需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性；并适时地加强免疫以诱导机体的再次应答。欲获得高特异性的免疫血清，则必须保证抗原的纯度，在条件许可的范围内应对抗原进行最大限度的纯化。此外，抗原的剂量、免疫途径、免疫时间以及动物和佐剂的选择等，都是影响免疫血清效价和特异性的重要因素。 二、小鼠抗绵羊红细胞抗体的检测（酶联免疫吸附实验） 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。具有灵敏度高、特异性强、快速方便等优点，是免疫学技术中应用最广的方法之一。它以酶作为标记物，与抗体或抗原联结，与相应的抗原或抗体作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量检测，即酶联免疫吸附实验（ELISA），亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶联免疫组织化学技术。酶与抗体或抗原后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。 根据检测目的和操作步骤不同，ELISA有双抗体夹心法、间接法、竞争法三种类型的常用方法。本次实验使用间接法对小鼠抗绵羊红细胞抗体的检测。 【实验方法】： 一、抗绵羊红细胞抗体（多克隆抗体）的制备 1.C的制备：脱纤维防凝处理的绵羊血，加入适量生理盐水混匀，2000rpm离心 5min，弃上清，再加入适量生理盐水混匀，2000rpm离心5min，弃 上清，利用生理盐水分别配制成20%和40%体积浓度的SRBC悬液。 2.小鼠免疫：利用上述不同浓度的SRBC悬液（本组使用20%浓度SRBC悬液）给 小鼠免疫，腹股沟皮下注射，每周1次，连续3周，每次0.1ml。 注意做好标志。 二、鼠抗绵羊红细胞抗体的检测（酶联免疫吸附实验） ①取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体，以洗涤液（200μ
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α' β' 血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。 3 ．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。 4 ．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕冷，寿命为1 5 年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。 二、选择实验动物的原则 1 ．3R原则3R 指的是reduction（减少）、replacement（替代）和refinement（优化）。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。 2 ．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。 3 ．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。 4 ．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。 三、免疫动物的选择 可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选 择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ- 免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素：（一）动物种系免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间）。实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。
免疫学实验报告 姓名:买迪来木.坎代尔学号:201020131222 班级:2010131 实验一：多克隆抗体的制备和抗体效价的检测 一：实验原理 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好的抗体。 质量好的抗体的标准：特异性强和效价高 多克隆抗体的概念：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。 多克隆抗体产生的基本原理： 初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在 Mø 和 Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆 B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制 T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。 二次反应产生的抗体主要是高亲和力的 IgG。机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的 Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗 原作用 1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。
1.用于免疫的动物 用于免疫的动物可以是哺乳类和禽类，可以是羊、马、兔、鸡等，实验室常用兔、山羊和豚鼠。 动物种类的选择标准：1.根据抗原的生物学特性和所需获得的抗血清数。 2.用于免疫的动物需适龄、健壮、无感染性疾病， 最好为雄性。 3.十分注意动物的饲养，消除动物个体差异及在免 疫过程中死亡的影响。 4.如果用兔子，最好用纯种新西兰兔，一组三只， 体重2-3kg为宜。 2.免疫途径： 途径有很多种：静脉注射、腹腔内注射、肌肉内注射、皮内注射、皮下注射、淋巴结内注射等。一般选择多点皮内或背部注射，每点注射0.1ml左右。 3.佐剂： 由于不同个体对于同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性的物质，以刺激机体产生比较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂作用：刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T 细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用佐剂：福氏佐剂。
多克隆抗体的制备 1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。 表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。超声后10000r/min离心5min，沉淀用500μl PBS悬起，后加入400μl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100μl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。将500μl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500μl 样品）。 凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。纯化蛋白置于4℃短暂保存。 2.蛋白复性 将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。更换复性液，4℃作用2h。再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。如蛋白浓度未满足免疫浓度，可将透析袋中复性后的蛋白置于50% PEG8000溶液中进行浓缩。 3.蛋白乳化 将蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(首免)/不完全弗氏佐剂混合，用注射器来回吹打，乳化2-3h。乳化效果的检测：在水中加入一滴上述乳化液，当乳化效果良好时，液滴就聚集在一起; 如果液滴分散开来，说明乳化不完全，继续乳化，直到理想的乳化液形成为止。 4.免疫程序 多选用健康成年家兔进行免疫。新购买的家兔饲养4-5d后无异常可进行免疫。免疫接种前先采集血样，留作后续试验使用。 采用脊椎两侧背部皮下多点注射接种，每点可注入0.5ml。第一次免疫（参考剂量：2mg）后2周进行第二次免疫，第二次免疫剂量为首免的一半（1mg）。二免3-4d后可耳缘静脉采血1ml，进行血清效价检测。二免后进行第三次免疫，剂量同二免。三免3-4d后可进行血清效价检测，直到血清效价达到要求后，可进行加强免疫（剂量同前，应用PBS代替弗氏佐剂与蛋白混合），大约一周后行颈静脉放血，收集血清。 5.血清效价检测 应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中抗体水平。 a.用包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液配方：碳酸氢钠2.93g；碳酸钠1.5g pH 9.6）将纯化 后的蛋白稀释为终浓度1-10μg /ml，100μl/孔，4℃包被过夜。 b.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。5%脱脂乳（PBS配制）37℃封闭2小时，200μl/ 孔。 c.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。加入PBS稀释好的一抗（待检血清），100μl/孔； 设阴性血清对照。置于37℃作用1h。 d.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。加入HRP标记的二抗1：5000稀释，100μl/孔，置
多克隆抗体技术 （Polyclone antibodies preparation technique） 一、概述 （一）多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受 该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相 应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生 的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产 生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。 （二）免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用 大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体， 则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制 备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进 行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是 选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降 解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的 分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内， 抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小 鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。加强计量为首次剂量的1／5～2／5。
在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。本技术专题介绍以成年家兔制备多克隆抗体 一、实验原理 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 二、实验材料 1. 实验动物 成年兔。 2. 实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 3. 实验试剂 (1) 抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 (2) 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂的成分 （福氏完全佐剂的制备：使用前在福氏不完全佐剂中加入适量杀死的分枝杆菌） 三、实验步骤 (一) 抗原的制备
抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 (二) 预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C 放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 (三) 注射抗原 (2) 每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 (四) 收集血液 (1) 将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。 (2) 将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，可在-20°C保存数年。 (五) 结果检测 生物科研https://www.doczj.com/doc/ed19035339.html,提醒： 1. 抗Ig的效价测定：琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。 2. 纯度鉴定：采用琼扩法。中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的
斑马鱼多克隆抗体制备方案 斑马鱼是现代生命科学、健康科学和环境科学等研究的重要模式动物，我国的斑马鱼研究群体日益壮大，相比于大小鼠这类模式动物，斑马鱼个体小，可进行大规模的养殖，其体外受精方式可以让科研工作者研究时直接进行胚胎操作，并且斑马鱼的繁殖能力很强，每周可产卵约100-500个。在斑马鱼卵受精后，它会快速发育，早期身体呈现透明状，用显微镜等设备可清楚观察其表型，现已成功运用于发育生物学、神经生物学、肿瘤病理学、药物学、毒理学等相关领域。 2018年10月11日-14日，全国（全球华人）斑马鱼PI大会大会在武汉举行，展会期间来自全国各地研究院所的斑马鱼专家与学者就斑马鱼抗体制备的技术手段，以及预期达到的实验效果和特异性等问题进行了沟通和交流。随着斑马鱼研究群体日益壮大，斑马鱼抗体作为一项重要的工具也成了科学家的一道难题。 很多科学家反馈市售斑马鱼抗体无法满足实验需求，不是找不到抗体就是抗体特异性达不到要求。人和小鼠物种的抗体为什么不能用于斑马鱼研究呢?斑马鱼虽然和人的亲缘性就很近，同源性高，但很多蛋白质的差别很大，故而不能通用，斑马鱼抗体的定制就成为一个好的选择。 多克隆抗体能够识别多个抗原表位，同时具有制备周期短、成本低、应用广泛等优点，常用于斑马鱼抗体的制备。物种上可以提供兔、大鼠、小鼠、豚鼠、羊等多个宿主在内的多抗制备。 多克隆抗体制备技术流程： ◆根据斑马鱼蛋白质序列设计免疫原，从源头保证抗体特异性； ◆采用皮下多点注射，淋巴结免疫等方式，搭配自主研发佐剂以提高抗体效价，针对免疫原ELISA效价至少1：160000； ◆采用抗原特异性亲和纯化； ◆斑马鱼组织裂解液做为检测抗原，内源性验证，保住抗体特异性。 在蛋白质抗原难以获得，或对抗体特异性要求很高的情况下，多肽抗原显示出其独特优势。与蛋白质抗原相比，多肽抗原制备容易，快速，价格较低，设计方案可选择空间更大，是一种常用的免疫原。当客户需要区分同源性较高的家族蛋白质时，或需要制备磷酸化，甲基化，乙酰化等修饰性抗体时，多肽就成为重要或者唯一的免疫原选择。但是，多肽免疫原也具有其局限性，一般说来，多肽免疫原制备的抗体识别的是线性抗原决定簇，对其应用有一定限制。在选择多肽作为抗原时，也需要结合客户实验需求，根据蛋白性质给出最容易产生抗体的序列选择。 具体如下： （一）感染或免疫动物 （1）动物的选择：可作病原体或病原体相关抗原感染或免疫的选择对象有家兔、山羊或绵羊、马和豚鼠等实验动物。动物种类的选择主要是根据抗原的特性主所要获得抗体的量和用途。如马匹常用于制备大量抗毒素血清；豚鼠适用于制备抗酶类抗体和补体结合试验用的抗体，但抗血清产量较少。对蛋白质抗原，大部分动物均适合，常用的是家兔和山羊；对于难以获得的抗原，且抗体需要量少，可用纯系小鼠制备。免疫用动物应选适龄、健壮，最好为雄性，每批免疫宜同时使用数只动物。 （2）抗原种类（或类型）的选择：根据所制备抗血清的用途选用不同类型的抗原，如制备用于筛选细菌表达cDNA文库或免疫沉淀，最好选用降解的蛋白质抗原，而用于筛选真核细胞转染系统表达的cDNA文库或免疫沉淀，最好选用自然的蛋白质抗原。若制备抗独特型抗体，所用抗原可以是可溶性Ig分子，或者是完整的细胞，也可以是基因工程表达产品独特型决定簇、人工合成多肽及抗原化抗体等。目前，以各类病原生物活体感染动物而获得多克隆抗体（抗血清）作为检测抗体，仍是常用方法。
间接ELISA法效价检测抗血清效价 通过间接ELISA法来确定抗原最佳包被浓度 (方阵滴定，也叫棋盘滴定法) 。 以兔高免血清多抗效价检测为例 1. 抗原用包被缓冲液CBS (0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)按1μg/ml浓度用作连续1:2倍比稀释，每个稀释度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶标板中，覆膜密封（防止水分挥发）4℃包被过夜(12h以上)。 2. 次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，每孔加入150μl封闭液(含2% BSA的包被缓冲液CBS），室温（25℃）2h以上。 3. 用洗涤液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此时将待测高免阳性血清和空白阴性血清用抗体稀释液（含1% BSA 的PBS缓冲液,pH7.4）分别从1:500开始做连续1:2倍比稀释，按下图分布模式100μl/孔，37℃ 1h。 4. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗体稀释液1:3000稀释HRP标记羊抗兔IgG，Frdbio，Cat No.:SAB90200H）,37℃孵育1h。 5. 取出拍干，洗涤液洗板3次，每孔加入100μl单组份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室温孵育5～20min（根据颜色的改变速度）。 6. 每孔加入50μl终止液（0.5M H2SO4）。 7. 在酶标仪上读取450nm/630nm的吸光度。 标准的结果分布模式应该如上图所示： ELISA酶标板显色由阴阳性区域第一行第一列孔向外显均匀放射状递减；如果在包被梯度方向上OD450过高无梯度，应该继续降低包被浓度；反之，则增加。同理，如果在免疫血清稀释度方向上OD450过高无梯度，则应继续加大稀释度，反之，则减小。 8. 最佳包被浓度的确定: 阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/其左孔OD值恰好为2倍关系且OD值不低于1.2,且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异，此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。同理也可以参照此方法确定阳性血清的最佳稀释倍数。 如果方阵滴定的数值结果不能如图分布，则需要重新设计方阵实验。 9. 以最佳包被浓度将抗原按照上述方法包被到酶标板同时封闭，将阴性/阳性血清依次倍比稀释，100μl加到酶标板孔（最好做复孔），然后依次加入二抗、底物显色，读取OD值。 对应稀释度阴性血清OD值的2.1倍确定为阳性值，也称Cut-off值，这个是检验学上的常用方法，而往往制备抗体的高免血清的稀释度都比较高，其对应稀释度的阴性血清值接近于空白值，所以这个判断方法作为ELISA稀释终点没有意义，Frdbio定义ELISA终点方法为：OD值-空白值或阴性对照值≧0.100（前提条件是空白孔值/阴性对照孔OD值﹤0.050），可以根据自己的实验室具体情况自己确定合适的终点判定标准。
多克隆抗体(polyclonal antibody)制备 1. 免疫动物：两只新西兰兔 2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。 3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 4. 免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。 5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。 6. 第0星期采血2ml（获得0.5-1ml免疫前血清） 完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。 第2星期 完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。 第4星期 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100μg抗原免疫兔。
第5星期 取检测血清20-30ml 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测， 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。 第6星期 如果检测阳性第一次采血20-30ml, 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔； 如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。第7星期 第二次采血20-30ml, 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔； 如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。 第8星期
第三次采血20-30ml, 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。 第9星期 末次放血20-30ml, 纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。 7. 注意：在整个项目中，兔子需要保持9周的免疫和放血。检测的结果将决定这个项目的继续、修改或终止 【注意事项】 大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下： 1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。 2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况，一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。 3.第三种就是忌用，就是说明药物在此类人群中有明确的不良反应，应该是由医生根据病情给出用药建议。如果一定需要这种药物，就可以联合其他的能减轻不良反应的药物一起服用。大家以后在服用药物的时候，多留意说明书，留意注意事项，避免不良反应的发生。 本文到此结束，谢谢大家!
绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异 性鉴定 董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川 【摘要】绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为 2.6×104和5.2×104的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.%GFP is one of the most popular fluorescent proteins used to detect and quantify targeted proteins in living organ-isms.To develop a high sensitive antibody for its detection or signal capture in di fferent kind of organisms,6×His-tagged and GST-tagged prokaryotic expression plasmids,pET28A-gfp and pGEX-2T- gfp,were constructed,by insertinggfpinto the pGEX-2T and pET28A vectors respectively and then were transformed intoEscherichia coli BL21(DE3)for protein expres-sion. 12% SDS-PAGE analysis results showed that the molecular weights of the fusion protein 6×His-GFP and GST-GFP were
自制多克隆抗体效价ELISA测定方法 实验目的 ELISA 方法检测自制多克隆抗体效价。 实验试剂 均为常规试剂，尽量购买同一批次试剂，以保证实验的均一性。 实验设备和材料 可拆卸ELISA板为JET公司产品。 操作步骤 （一）最佳包被浓度的确定（方阵法） 将重组蛋白1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400倍稀释，以100 μL每孔于四度包被过夜，PBST洗涤三次，每次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净，用5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h，用阴性血清和阳性血清分别稀释1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12 800、1:25600倍稀释作为一抗，100 μL每孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，用HRP标记的羊抗鼠二抗（具体浓度参考不同公司说明书的ELISA工作浓度），100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次后，加入新鲜配制的显色液，50 μL/孔，37℃作用15～30 min，加入终止液，50 μL/孔，然后在酶标仪上读取OD450 nm吸光值。以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N 最大的抗原血清稀释度作为抗原最佳包被浓度。 （二）效价测定 最佳包被浓度100 μL每孔包被ELISA板，4℃放置过夜，PBST洗涤
三次，每次350μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。5%脱脂乳37℃ 包被2 h，PBST洗涤三次，每次300 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打 干净。将阴性和阳性血清1:400开始进行四倍比稀释后，稀释12孔， 以100 μL/孔加入ELISA板作为一抗37℃孵育1 h，PBST洗涤三次，每 次350 μL，在滤纸或其他吸水纸上拍打干净。加入HRP标记的羊抗鼠 二抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤三次每次350 μL，在滤纸 或其他吸水纸上拍打干净。加入新鲜配制的显色液，50 μL/孔，37℃ 作用15-30 min，加入终止液，50 μL/孔，然后在酶标仪上读取OD450 nm 吸光值。 （三）结果判定 以P/N>2时阳性血清的最大稀释倍数作为其抗体效价。将血清-80℃冻存。 计算 P/N=OD阳性血清/OD阴性血清 注意事项 （1）所有试剂需用超纯水配制。 （2）显色液可以购买无需新鲜配制的单组份试剂。所用试剂一旦倒出，不用回收，以免污染，因此应提前计算好所需试剂量。 （3）做实验之前要确定仪器的情况，确认仪器能够正常使用。终止 液可移至仪器旁加，样品加入终止液后宜立即测定，不可放置过久。
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。 免疫佐剂
抗体的制备方法与原理 抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）选择免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等，多用家兔和山羊。因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。 用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为雄性。 若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径 免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。 常用的佐剂是弗氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全弗氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。 1．佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。 ⑴弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA） 羊毛脂 1 份 石蜡油 5 份 混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。 ⑵弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA） 弗氏不完全佐剂10ml 卡介苗10mg～200mg 卡介苗可100℃10min灭活处理。 初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，一
免疫学实验报告 ——多克隆抗体制备 生物科学与工程学院 生物技术 吴凡 201020131112
多克隆抗体的制备和抗体效价的检测 实验一多克隆抗体的制备 一、目的 1. 加深对抗体基本知识的了解。 2. 了解多克隆抗体的制备基本方法及动物免疫的基本原理。 二、原理 抗原抗体反应 抗原抗体反应:是指抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。 原理：抗原抗体反应的物质基础是抗原分子表面的抗原决定簇与抗体分子高变区之间的互补结合，在适宜条件下出现可见反应。免疫应答的效果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似。 把抗原注射到实验动物体内时，抗体会不同程度的与抗原结合，在抗原的刺激下，在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 动物的选择： 1 动物的种类和种系：供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的免疫应答受动物的遗传基因影响，同一种系的动物对不同抗原的免疫应答和不同种系的动物对同一抗原的免疫应答均不尽相同。抗原的来源与免疫动物
的亲缘较远，产生的抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生的抗体的效价就差。 2 动物的生理状况：由于个体差异的存在，同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，产生的抗体的效价有很大的差异。与动物的年龄和营养状况密切相关。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。 3 抗血清的需要量：根据实验中抗血清的需要量，选用最经济的动物、免疫动物的只数。一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。在这次实验中，我们用的是兔子。 三、动物的免疫 1 抗原剂量：抗原的免疫剂量应根据抗原的免疫原性强弱、抗原来源难易、动物的种类、免疫周期等来选择抗原剂量。 免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。此次免疫中，我们选用家兔做免疫动物，首次抗原剂量为：抗原500ug+免疫佐剂（FCA）500ug，之后的加强免疫的剂量相同，每2周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂。 2 注射途径：抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响的时间越短。吸收越快，单位时间的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，毒副作用也越强。根据免疫应答过程中各阶段的特点，选择注射途径。常用的途径有：
青鱼Dazl基因的原核表达及其多克隆抗体制备 王艺舟;潘启华;王乾;夏必琳;罗君志;方健;邓羽;廖明聪;陈天圣 【摘要】实验进行了青鱼(Mylopharyngodon piceus)Dazl基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证.首先将青鱼Dazl基因的编码区利用重组表达引物从pCS2-MpDazl质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a 载体中,构建pET-28a-MpDazl重组表达载体.然后将pET-28a-MpDazl重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白.将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和Western blot检测.结果:成功构建重组表达载体pET-28a-MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性. 【期刊名称】《淡水渔业》 【年(卷),期】2019(049)003 【总页数】5页(P27-31) 【关键词】青鱼(Mylopharyngodon piceus);Dazl;原核表达;多克隆抗体 【作者】王艺舟;潘启华;王乾;夏必琳;罗君志;方健;邓羽;廖明聪;陈天圣 【作者单位】华中农业大学水产学院,农业部淡水生物繁育重点实验室,武汉430070;华中农业大学水产学院,农业部淡水生物繁育重点实验室,武汉430070;华中农业大学水产学院,农业部淡水生物繁育重点实验室,武汉430070;华中农业大学
睾酮多克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立 摘要:采用优化的碳化二亚胺法制备睾酮(TES)人工抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA标准曲线｡标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.096~92.200 ng/mL,相关系数R2=0.972 2,半数抑制浓度(IC50)为 2.800 ng/mL,最低检测限(LOD)为0.035 ng/mL;抗体与去甲睾酮的交叉反应率为22.3%,与其他检测化合物的交叉反应很小或忽略不计｡羊尿20倍稀释后进行添加回收试验,其添加值与检测值的相关系数为0.985 2｡因此,该免疫学方法可用于动物尿液中睾酮残留水平的定量分析｡ 关键词:睾酮;人工抗原;多克隆抗体;间接竞争 ELISA Preparation and Its Immunoassay of Testosterone Polyclonal Antibody Abstract: A standard curve of indirect competitive ELISA (icELISA) was developed for the determination of testosterone (TES) residue in urine. The artificial antigen of TES was synthesized by carbodiimide method (EDC) and then used to immune New Zealand white rabbits for the preparation of polyclonal antibody. The results showed that the linear detecting range of the standard curve in PBS was from 0.096 to 92.200 ng/mL, the correlation coefficient (R2) was 0.972 2, the limit of detection(LOD) and IC50 value was 0.035 ng/mL and 2.800 ng/mL, respectively. The cross-reactivity of the antibody to nortestosterone was 22.3% and slight or negligible to other compounds. Under 20-fold dilution in sheep urine, a correlation coefficient of 0.985 2 between concentration added and concentration determined was observed. It indicated that this assay could be incorporated into a quantitative monitoring program for the rapid screening of TES residue in urine. Key words: testosterone; artificial antigen; polyclonal antibody; indirect competitive ELISA 类固醇激素是生物体内产生的一类调节机体代谢功能的微量物质,又称化学信息素｡此类物质有较强的蛋白质同化作用,可以提高蛋白质沉积,降低脂肪含量,从而提高饲料转化效率[1]｡睾酮是哺乳动物体内常见的具有雄激素作用的类固醇激素,它可以增加肌肉含量,提高骨骼强度,并在雄性生殖器官的发育中发挥重要作用,因而在临床医学中得到应用｡外源性睾酮也被运动员非法使用,以提高比赛成绩;养殖场使用睾酮激素后,可以提高经济效益｡然而,长期摄入睾酮类激素会导致消费者内分泌紊乱､性早熟,大大增加致癌､致畸的风险[2]｡因此,自1986年以来,欧盟委员会就禁止在肉食性动物养殖中以促进生长为目的使用自然或人工合成的激素,以保护消费者可能因食用激素的残留物或其代谢物而引起的发育问题､神经问题､遗传毒性和癌症问题[3]｡睾酮传统的理化检测方法包括液相色谱-质谱(LC-MS)[1,4]和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)[5]等方法｡这些方法灵敏度高､特异性强,但样品前处理繁琐,不适合大批量的市场监测要求｡而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上,其主要优点是亲合力高､快速､简单､经济实用,能够实现对生物液体的小体积､大批量检测,逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速检测的方法之一[6]｡ 本研究以睾酮标准品为起始反应物,经过一系列化学反应制备人工抗原,通过免