多克隆抗体技术及其制备技术
1.多克隆抗体的概念
抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。
2.免疫动物
供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。
抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。
抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不
同而不同。剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。加强计量为首次剂量的1／5～2／5。
免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg.次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。如要制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。
两次注射的间隔时间应长短适宜，太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般间隔时间应为5~7天，加佐剂者应为2周左右。
注射的Ig纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。
3.佐剂的应用
对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
1．佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。
⑴弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）
羊毛脂1 份
石蜡油5 份
混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。
⑵弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA）
弗氏不完全佐剂10ml
卡介苗10mg～200mg
卡介苗可100℃10min灭活处理。
初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一
般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。
⑶脂质体：是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。
⑷油佐剂：采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。目前应用最广的矿物油。
10号白油（石蜡油）100ml
硬脂酸铝2g
司本80 6ml
混合加热融化，分装。用时按下列配方进行乳化。
油相3份
水相（加4%吐温－80）1份
先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于乳化。
2．乳化将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。当大量乳化时，可采用胶体磨进行。
乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。
根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。
注射间隔时间带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2～4周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1～2周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5天左右
的间隔时间。
可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。
（六）抗体的鉴定
1.抗体的效价鉴定不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体的目的都是要求较高效价。不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一。鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法，以资比较。如制备抗抗体的效价，一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
2.抗体的特异性鉴定抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，它的识别能力就强。衡量特异性通常以交叉反应率来表示。交叉反应率可用竞争抑制试验测定。以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC50时的浓度，并按下列公式计算交叉反应率。
如果所用抗原浓度IC50浓度为pg/管，而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无穷大时，表示这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为0，即该血清的特异性较好。
3.抗体的亲和力是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示，K的单位是L/mol，通常K的范围在108～1010/mol，也有多达1014/mol。抗体亲和力的测定对抗体的筛选，确定抗体的用途，验证抗体的均一性等均有重要意义。
4.抗血清的冻存
抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置－20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。注意避免反复冻融。也可将抗血清冷冻干燥后保存。有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
用于免疫的动物
作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r－免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，
因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
5.免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
佐剂
由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。
6.免疫方法
抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2～3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。
抗血清的采集与保存
家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4。C冰箱保存。
7.抗血清质量的评价
在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。
1．效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。而后者则粗糙得多。
（1）放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。
（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产
生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。
球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。
2．特异性测定
抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常，特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。
S=y/Z×100%
S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。
如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。
3．亲合力在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012L/mol之间，也有高达1014L/mol的。
计算亲合常数的方法20余种，计算出的K都不能真实反映实验情况，只能作为参考。
免疫失败的可能原因及应采取的措施
有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。
（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大
免疫动物的数量。
（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。
（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。
（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。
（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。
（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。
8.免疫血清的制备
免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。
一、原理
具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物（即多克隆抗体）。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。
二、免疫方法
根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。
1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；
2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）下
称FCA-IgG）液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧窝及鼠蹊部皮下。
4.间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。
5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液（人IgG）耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外，也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂（FIA）乳化的抗原（人IgG)（简称FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。
三、放血
（一）心脏采用血法
1.家兔仰面，四肢缚于动物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；
2.剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；
3.用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；
4.用50ml注射器（连接16号针头），倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；
5.将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。
（二）颈动脉放血法
1.家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；
2.沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；
3.分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；
4.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；
5.用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；
6.松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。
四、分离血清
将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂（0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度），分装后置4℃冰箱中保存备用。
五、结果鉴定
以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。六、材料
（一）动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。
（二）器材：剪刀、镊子、注射器（2ml、50ml）附针头（9号、6号）、称量瓶（10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。
（三）试剂
1.灭菌生理盐水；
2.纯化人IgG(10mg／ml)；
3.消毒酒精及碘酒；
4.羊毛脂；
5.石蜡油；
6.活卡价苗（BCG)(75mg／ml)；
7.弗氏不完全佐剂（FIA）制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中（每瓶10ml)，高压灭菌（8磅20分钟）后保存备用。8.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA-IgG）的制备：将FIA予温（60℃30分钟），吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg／ml）牨_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。
七、注意事项
1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。
2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡（频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合
后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。
3.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物（0.005mgN）产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时，可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。
4.抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。
5.免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，同时于两侧肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。
多克隆抗体的原理及制作方法 一、原理 多克隆抗体是由针对多种不同抗原表位的抗体组成的混合物。外源性抗原初次进入动物体内后，可引发机体初次免疫应答，即在抗原呈递细胞（antigenpresenting cell，APC）和T细胞的作用下，未 成熟B细胞被激活分化为产生抗体的浆细胞，对于大多数可溶性蛋白抗原而言，动物注射后5～7天，血清中开始出现抗体，并在12天左右达到顶峰，然后逐渐下降。初次免疫应答产生的抗体持续时间较短，亲和力也较低。但是受抗原刺激的B细胞除了分化为抗体产生细胞外，还增殖形成大量记忆性B细胞，它们在实施加强免疫时被快速激活，加强免疫后抗体滴度迅速上升，并持续更长时间，抗体合成率也比初次反应增加几倍到几十倍，加强免疫后7～14天出现抗体的峰值。由于记忆B细胞的存在，需要更少的抗原刺激即可引起再次免疫应答。记忆B细胞是长寿细胞，因此，特异性抗体应答在最后一次加强免疫之后6个月到一年都会存在。本节介绍用佐剂乳化的抗原免疫动物获得多克隆抗血清的方法。该法可用于免疫家兔，小鼠、大鼠或地鼠，也可用于更大的动物如绵羊、山羊或马。 二、材料 （一）动物选择 根据需要可选择适当品系的家兔，小鼠，大鼠或地鼠等动物进行免疫获得抗体。动物的选择取决于所需的抗血清量以及特异性抗原的
物种来源和免疫动物物种之间进化上的差异。家兔常被选作免疫动物，因为兔与人、兔与小鼠之间的遗传学差异大，而人和小鼠来源的蛋白是最经常被研究的对象。每次获取25ml血清的采血量，对兔本身没 有明显的损伤。 （二）抗原 制备优质抗血清很大程度上取决于抗原的质量、纯度和数量。常用纯化的抗原或部分纯化的抗原免疫动物，所用抗原往往是蛋白质或肽。一般而言，细菌或病毒蛋白如血凝素或细菌包膜蛋白有很强的免疫原性，而哺乳动物蛋白如多肽类激素或细胞膜受体则免疫原性较弱。有时也会用到与适当的蛋白质载体、细胞或细胞与组织提取物相交联的半抗原（多糖、核酸、脂类和小分子化学物质等）以增强半抗原的免疫原性，通过化学方法将半抗原连接到已知的免疫原性强的载体蛋白上，常用的载体蛋白有匙孔戚血蓝素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清蛋白（OVA）等。对于蛋白质抗原，可以是天然蛋白或变性构 象的蛋白，这主要决定于抗体的用途。比如用于筛选细菌cDNA表达 文库或免疫印迹的抗体，最好用变性蛋白制备抗血清；而筛选真核生物转染系统表达的cDNA产物、或对天然细胞合成的蛋白进行免疫印 迹检测时，最好用天然蛋白质制备的抗血清。需要注意的是，少量的非目标污染物往往比目标免疫原的抗原性更强，所得抗血清对非目标蛋白的活性比对目标蛋白的结合能力更强。 （三）佐剂
多克隆抗体制备免疫小鼠 简介 多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。 流程 多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤： 1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原， 可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。 2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠 体内，观察免疫反应情况。 3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清， 获得抗体。 4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试 验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术， 对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。 关键步骤 抗原制备 抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。以下是一些常见的抗原制备方法： •纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。 •重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。 •合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。 适当的佐剂 适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的
活化。常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。 免疫小鼠免疫 将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等 方式将抗原注射到小鼠体内。注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。 血液采集和抗体收集 一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。 抗体筛选和纯化 获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进 行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。筛选出特异性较好的抗体后，可以通过亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
上海师范大学 实验报告 专业、年级食品科学与工程班级1班姓名刘杰学号110153414 课程名称免疫学实验名称硝基呋喃多克隆抗体的制备（可溶性抗原CPAHD-OV A)实验日期 实验目的 动物性食品作为一大类食物，主要是指来源于猪、牛、羊、马、狗、兔、禽以及水产类动物的，可供人食用多的肉、乳、蛋及制品和副产品【1】。但动物性食品又较易腐败变质，从生产、加工、贮运到消费各个环节，很容易受到环境有毒有害物质污染。这些有毒有害物质除对畜禽造成直接危害外，其在动物体内积蓄和富集，通过食物链成为人类健康的潜在威胁【2-3】。众多动物性食品安全问题中，兽药及药物添加剂残留问题是影响动物性食品安全的最主要因素之一。近年来水产品硝基呋喃类药物残留超标事件屡屡被发生，严重威胁人民身体健康和我国水产品的出口贸易。加强对硝基呋喃类药物残留检测和控制有着十分紧迫的现实意义。【4】 基本原理 免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。 材料 (一)动物：健康雄性家兔2只 (二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。 (三)试剂 1.灭菌生理盐水； 2.纯化人IgG(10mg／ml)； 3.消毒酒精及碘酒； 4.弗氏不完全佐剂（FCA） 5.弗氏完全佐剂（FIA） 6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。 7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。 免疫方法 1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；
多克隆抗体技术及其制备技术 1.多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD 等五类抗体。 2.免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不
多克隆抗体技术 （Polyclone antibodies preparation technique） 一、概述 （一）多克隆抗体的概念 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受 该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇刺激机体，相 应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生 的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产 生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。 （二）免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用 大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体， 则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制 备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进 行免疫。 抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是 选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降 解的蛋白质抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的 分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。 抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内， 抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小 鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。加强计量为首次剂量的1／5～2／5。
泰实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
***蛋白多克隆抗体的制备： 试剂: 生理盐水(或PBS) 弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant， FCA) 弗氏不完全佐剂(Freund’s inc omplete adjuvant， FIA) 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3 免疫原：**********************。(免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。) 动物选择:如兔子:兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。 免疫 1.免疫前与兔耳朵耳缘处静脉采血作为阴性对照。或备用几只兔子用于制备对照抗原 2.第一次抗原免疫使用生理盐水稀释免疫原，然后与FCA进行1:1混合。抗原和FCA完全混合形成稳定的乳剂（如使用100ml 的FCA与100ug纯化后的免疫原再加生理盐水至2ml），将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注
射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答. 3.第2,3,4次抗原免疫使用生理盐水稀释免疫原，然后与FIA 进行1:1混合。抗原和FIA完全混合形成稳定的乳剂（如使用100ml的FIA与100ug纯化后的免疫原再加生理盐水至2ml），将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答. 注：免疫注射共四次，两周一次，八个星期后，在被免疫的兔子耳缘静脉采血，与阴性对照量相同,每次免疫后7～14d抽取少许静脉血，•分离血清，以备检测免疫效果。于第4次免疫后14d试血 4.将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，再在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清，在-20°C保存. 血清的纯化：采用饱和硫酸铵方法纯化抗血清［４］，具体步骤：①取５００ｍＬ蒸馏水，加热至８０℃，将４００ｇ硫酸铵（分析纯）溶于蒸馏水中，加热搅拌使其溶解，待降至室温，取上清液即为饱和硫酸铵，用浓氨水调节ｐＨ至中性；
多克隆抗体 传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生
多克隆抗体的制备方法 多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。 一、抗原的选择 在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。 二、免疫小动物 免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。 三、免疫过程 免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。 四、细胞融合与筛选 经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。 五、生产与纯化 经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。 六、性质鉴定与应用 纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
多克隆抗体名词解释 多克隆抗体是指由多个B细胞克隆所产生的抗体，能够针对 同一种抗原的多个不同的位点进行识别和结合。与单克隆抗体相比，多克隆抗体具有更高的亲和力和更广泛的抗原识别能力。多克隆抗体因其独特的特性被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。 多克隆抗体的制备过程通常包括以下几个步骤：首先，通过免疫动物（如小鼠、兔子等）免疫目标抗原，以激发其免疫系统产生抗体。接着，从免疫动物体内采集血清，其中包含了众多的B细胞克隆所产生的不同抗体。再经过一系列的加工和处理，如离心、加热灭活等，最终得到多克隆抗体产品。 多克隆抗体具有以下几个优点：首先，多克隆抗体能够识别和结合抗原的不同位点，从而提高抗原的检测敏感性和特异性。其次，多克隆抗体可用于大规模和复杂多样的抗原检测，覆盖范围广，适用性强。此外，多克隆抗体的制备工艺相对简单，成本较低。 然而，多克隆抗体也存在一些局限性。首先，多克隆抗体的制备过程中可能会产生一些非特异性的抗体，从而降低了其特异性和纯度。其次，多克隆抗体在不同免疫动物体内可能会产生批次差异，导致其品质和稳定性存在一定的波动。此外，多克隆抗体由于来源于免疫动物，可能存在个体差异和免疫相容性问题。 为了克服多克隆抗体的局限性，科学家们也不断努力进行研究
和改进。例如，通过筛选和优化制备过程，可以提高多克隆抗体的特异性和纯度。此外，还可以利用单克隆抗体技术将多克隆抗体中特异性较高的成分筛选出来，以获得更具特异性和统一性的抗体产品。 综上所述，多克隆抗体是一种能够针对同一种抗原的多个不同位点进行识别和结合的抗体。多克隆抗体具有广泛的应用价值，但也存在一些局限性。通过不断的研究和改进，科学家们正在努力提高多克隆抗体的质量和稳定性。
多克隆抗体的制备方法 摘要： 一、引言 二、多克隆抗体的概念与作用 三、多克隆抗体的制备方法 1.动物免疫 2.融合细胞培养 3.筛选与克隆 4.抗体检测与纯化 四、制备过程中的注意事项 五、应用领域与发展前景 六、总结 正文： 一、引言 多克隆抗体，作为一种具有广泛应用前景的生物制品，其在科学研究、医学诊断、生物制药等领域具有重要价值。本文将详细介绍多克隆抗体的制备方法，以期为相关领域的研究者提供参考。 二、多克隆抗体的概念与作用 多克隆抗体是指由多个B细胞克隆产生的具有相同抗原结合能力的抗体。它们可以识别并结合抗原的不同表位，从而提高抗体的针对性和广泛性。多克隆抗体在免疫检测、疾病诊断、治疗肿瘤和病毒感染等方面具有显著作用。
三、多克隆抗体的制备方法 1.动物免疫：选用适合的动物（如小鼠、兔子等）进行免疫，通常采用皮下注射或静脉注射的方式，使动物产生针对特定抗原的免疫应答。免疫周期一般为2-3周，期间需要多次注射抗原。 2.融合细胞培养：收集免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞，进行细胞融合。融合后的细胞能够在体外培养条件下生长繁殖，并分泌针对抗原的抗体。 3.筛选与克隆：筛选出具有特定抗原结合能力的杂交瘤细胞，对其进行克隆化培养。克隆化培养有助于获得具有相同抗原结合能力的抗体细胞株。 4.抗体检测与纯化：对筛选出的抗体细胞株进行抗体检测，筛选出具有较高抗体滴度的细胞株进行体外培养。培养后的抗体需进行纯化，以获得高纯度的多克隆抗体。纯化方法包括柱层析、凝胶过滤等。 四、制备过程中的注意事项 1.抗原的选择：选用具有良好免疫原性的抗原，以提高抗体的免疫应答效果。 2.动物免疫方案：根据动物种类和抗原性质制定合适的免疫方案，包括抗原剂量、免疫途径和免疫周期。 3.细胞融合与培养：确保细胞融合充分，避免未融合的细胞或融合细胞的自融合。培养过程中注意观察细胞生长状态，以保证抗体产量和质量。 4.抗体检测与纯化：采用可靠的抗体检测方法，如ELISA、免疫组化等。纯化过程中注意抗体的活性、稳定性和纯度。 五、应用领域与发展前景 多克隆抗体在科学研究、医学诊断、生物制药等领域具有广泛应用。随着
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。 免疫佐剂
多克隆抗体的应用及现状 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体群体，与单克隆抗体相比具有更强的多样性和高度的特异性。多克隆抗体广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域，成为重要的实验和临床工具。本文将从多克隆抗体的制备、应用以及现状三个方面进行详细介绍。 首先，多克隆抗体的制备是实现其应用的基础。多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：首先，将目标抗原免疫动物（如兔、小鼠等）多次注射，刺激其产生特异性抗体。然后，从动物体内收集血清，分离抗体。接着，将抗体与大量不同的抗原冲突，筛选出特异性较高的抗体克隆。最后，对特异性较高的抗体进行扩增和提纯，得到多克隆抗体。 多克隆抗体的应用广泛涉及多个领域。在生物医学研究中，多克隆抗体常用于蛋白质表达与定位、蛋白质相互作用和信号转导的研究。例如，通过使用多克隆抗体可以检测特定蛋白在细胞内的定位和表达水平，进一步了解其功能及参与的生物过程。此外，多克隆抗体还可以用于免疫组织化学、免疫印迹和流式细胞术等实验技术，以便更全面地研究生物学问题。 在临床诊断中，多克隆抗体也有重要应用。多克隆抗体可以用于特定抗原的定量测定，如肿瘤标志物的测定、感染病原体的检测等。同时，多克隆抗体也可以用于免疫组织化学检测，辅助病理诊断。另外，多克隆抗体还广泛应用于临床病原体的荧光染色和免疫组化检测，用于快速定位和识别病原体，提高诊断效率。
在治疗领域，多克隆抗体已经取得了巨大的成功。多克隆抗体可以用于治疗多种疾病，如癌症、自身免疫疾病等。通过靶向特定抗原，多克隆抗体可以选择性地破坏癌细胞，抑制肿瘤生长和转移。此外，多克隆抗体还可以通过激活免疫系统来增强机体对疾病的免疫反应。近年来，许多多克隆抗体药物已经获得上市和临床使用，成为治疗疾病的重要手段。 然而，多克隆抗体也存在一些局限性和挑战。首先，多克隆抗体制备过程中存在批次差异，导致抗体的特异性和亲和力有一定的波动性。此外，多克隆抗体的批量生产和提纯成本较高，难以大规模应用。为了解决这些问题，近年来，单克隆抗体的发展和应用得到了快速发展。单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的抗体，具有更强的特异性和一致性。单克隆抗体已经成为当前生物医学研究和临床治疗的主流。 综上所述，多克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。随着单克隆抗体技术的不断发展和改进，预计多克隆抗体将逐渐被单克隆抗体所取代。然而，多克隆抗体作为一种重要的研究工具和药物，仍然存在一定的应用空间，并且在某些特定情况下可能仍然是更好的选择。因此，多克隆抗体的研究和应用仍然具有重要意义，在未来仍将继续发展。
基因重组技术和多克隆抗体技术研究 近年来，随着生物技术的迅速发展，基因重组技术和多克隆抗体技术在科学研 究和医学应用中得到了广泛的应用。 基因重组技术是指将不同基因的DNA片段拼接并组装成一个新的DNA分子，从而产生一个新的重组基因。这项技术的应用范围非常广泛，包括药物研发、生产农业和食品产品、肿瘤治疗等。 多克隆抗体技术是指通过注射人工制造的抗原，人体内会产生针对该抗原的抗体。这种技术可以用于疾病的检测、疫苗研究、免疫检测等领域。 基因重组技术和多克隆抗体技术的研究已经到了一个非常成熟和稳定的阶段。 接下来，我们来分别了解这两种技术的研究进展及应用。 基因重组技术的研究进展及应用 基因重组技术的研究始于20世纪70年代。现在，基因重组技术得到了广泛的 应用，包括： 1.在农业方面，基因重组技术可以帮助大量生产农作物和畜牧产品。例如，基 因重组技术可以为作物添加向量 DNA，使他们更抗性害虫、干旱和减少施肥等。 2.在药物研发方面，基因重组技术可以用于制造各种仿生蛋白质。这些蛋白质 可以用于治疗和预防疾病，如免疫调节剂和生长因子等。 3.在生物科技方面，基因重组技术可以用于生产大量的酶，如转录酶，从而促 进基因的研究。 4.在肿瘤治疗方面，基因重组技术可以通过合成和传递抗癌基因以抗击癌细胞 或免疫肿瘤细胞等。 基因重组技术可以通过多个步骤来实现：
1.将DNA片段插入向量，如大肠杆菌。向量往往是质粒，并且可以用来复制DNA分子。 2.通过DNA重组技术选择所需要的DNA。 3.将选定的DNA发送到表达主机中。 4.用已制成的重组蛋白或限制性内切酶来分析构建的DNA。 5.分离蛋白并对其进行纯化。 6.确定所制造的蛋白质是否达到所需的量和质量。 多克隆抗体技术的研究进展及应用 多克隆抗体技术也是一种现代生物技术，其研究一直在进行中。多克隆抗体技 术目前的应用包括： 1.可用于疾病的检测，例如：人类免疫缺陷病毒（HIV）检测和乙肝病毒检测等。 2.可用于疫苗研究。科学家可以使用多克隆抗体技术，将制造出一种针对特定 病毒的抗体，从而帮助预防疫苗。 3.在X光晶体学方面的研究。多克隆抗体可以用于确定特殊受体或蛋白质的三 维结构。 多克隆抗体技术的制备过程： 1.确定目标抗原并制备它。 2.将抗原注射到兔子、小鼠、猴子等动物的体内，获取动物血清中制造的抗体。 3.分离抗体。 4.纯化并测定多克隆抗体的特性和优点。
多克隆抗体和单克隆抗体的用途盘点 单克隆抗体的定义: 单克隆抗体是仅与目标蛋白某一特定表位结合的单一抗体。 单克隆抗体的制备： 简洁来说就是将免疫原注射到宿主动物体内产生免疫反应，之后 把 B 细胞从脾脏中移出，单种 B 细胞与骨髓瘤细胞融合为 B 细胞杂交瘤，成为一个永生化胞株。这样一来，杂交瘤的 B 细胞就会始终产出只识别单一表位的单克隆抗体，通常这个胞株会有一个特定 的克隆号（clone number），用来与其他胞株区分。杂交瘤接下来 可以被注射到小鼠的腹腔中大量生产，杂交瘤分泌富含抗体的一种 液体，被称作腹水，用注射器抽取纯化，就可获得大量的单克隆抗体。 多克隆抗体定义： 多克隆抗体是指与目标蛋白上多种不同表位结合的多种不同抗体. 多克隆抗体制备： 多克隆抗体的第一步和单克隆抗体一样，都是将免疫原注射到宿 主体内产生免疫反应，激活了多种B细胞。不同的是免疫过后，多 克隆抗体就直接从免疫宿主的血清中分别出来，或接着进行纯化， 没有与骨髓瘤细胞融合的过程。一旦宿主动物死亡，需要免疫新的 动物，这时血清中的抗体就会有所不同。虽然多抗每批次有稍微差别，但是由于它识别的表位多，这个差别影响并不算太大，而单克 隆抗体虽然价格偏高，可是特异性更强更稳定。可以说单抗和多抗
是各有各的优点。 多克隆抗体和单克隆抗体的用途： 1、定义多克隆抗体和单克隆抗体有用性的两个关键特征涉及它们各自对抗原的特异性和灵敏度。 2、抗体的特异性是由其结合域和目标抗原之间的相对亲和力打算的，而其他分子是存在的。对这种特异性的利用对免疫学讨论人员和临床医生来说是至关重要的，由于很多应用都是利用多克隆和/或单克隆抗体来特地检测目标分子。结合抗原特异性，抗体的灵敏度是一个重要的参数，打算了它在试验室的有用性。 3、高灵敏度的抗体特别适用于诊断应用，如免疫沉淀、West Blot 和酶联免疫吸附试验（ELISA），由于它们能够识别低水平的目标抗原。 免疫沉淀是一种分析技术，通过使用特异性结合抗原的抗体将抗原从混合物中分别出来。然后用固定化抗体或磁珠对产生的抗原-抗体复合物进行进一步处理，从而使抗原-抗体复合物在分析前从混合物中分别出来。 4、与免疫沉淀法一样，ELISA 可以使用多克隆或单克隆抗体来检测溶液中的目标抗原。 5、间接和夹心 ELISA 是两种免疫测定形式，在整个过程中使用两种类型的抗体：单克隆抗体由于对目标抗原的高特异性，通常首先应用（一级）；多克隆抗体由于能够以高灵敏度放大低信号，因此作为二级试剂更有用。
不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用 傅强;仇旭升;陈素娟;谭磊;宋翠萍;于圣青;丁铲;彭大新 【摘要】新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题.为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class Ⅰ NDV 9a5b株和Class Ⅱ NDV ZJl P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class Ⅰ和ClassⅡNDV V 蛋白的多克隆抗体.利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化.结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞.研究表明NDVV蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关.【期刊名称】《中国预防兽医学报》 【年(卷),期】2013(035)009 【总页数】5页(P702-706) 【关键词】新城疫病毒;V蛋白;蛋白表达;多克隆抗体;细胞嗜性 【作者】傅强;仇旭升;陈素娟;谭磊;宋翠萍;于圣青;丁铲;彭大新 【作者单位】扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;中国农业科学院
抗体的制备 为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。 一、多克隆抗体 大多数抗原是由大分子蛋白质组成，但只是抗原上有限部位的特殊分子结构能与其相应抗体结合，称此部位为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。 一种天然抗原性物质（如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等）往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。 在机体淋巴组织内可存在千百种抗体形成细胞（即B细胞），每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，当受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群，这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称之为细胞克隆（clone）。同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，亦可称之为单克隆抗体。 在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是第一代抗体。由于这种抗体是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。 二、单克隆抗体 体内免疫法很难获得单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。如能将所需要的抗体形成细胞选出并能在体外进行培养即可获得已知特异的单克隆抗体。1975年德国学者Kohler 和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（sheep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性，又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力。它们是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体，只要这种抗原能引起小鼠的抗体应答。 这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第二代抗体。 单克隆抗体由于纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性，但单克隆抗体多为双价抗体，与抗原结合不易交联为大分子集团，故不易出现沉淀反应。单克隆抗体的应用大促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性。 单克隆抗体亦可与核素、各种毒素（如白喉外毒素或篦麻毒素）或药物通过化学偶联或基因重组制备成导向药物（targetting drug）用于肿瘤的治疗，是一种新型免疫治疗方法，有可能提高对肿瘤的疗效。 单克隆抗体亦可用于对各种免疫细胞及其它组织细胞表面分子的检测，这对免疫细胞的分离、鉴定及分类及研究各种膜表面分子的结构与功能都具有重要意义。 三、基因工程抗体 自1975年单克隆抗体杂交瘤技术问世以来，单克隆体在医学中被广泛地应用于痢疾的诊断及治疗。但目前绝大数单克隆抗体是鼠源的，临床重复给药时体内产生抗鼠抗体，使临床疗效减弱或消失。因此，临床应用理想的单克隆抗体应是人源的，但人-人杂交瘤技术目前尚未突破，即使研制成功，也还存在人-人杂交瘤体外传代不稳定，抗体亲合力低及产量