多克隆抗体制备流程
多克隆抗体制备流程有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选
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抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。
抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。
抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤
多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。
具体实验步骤如下：
1.兔子的准备
挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用）
1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；
1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；
1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；
1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；
1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；
1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。
2. 兔子的免疫
2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。
2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；
2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。
3.效价检测
3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。
3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在此基础上倍比稀释，于37℃孵育1 小时。
3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP 标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释），于37℃孵育45分钟。
3.7倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB 底物（Sigma 单组份TMB ）37℃孵育5—20分钟(根据颜色深浅来决定显色的时间)。
3.8每孔加入50ul的终止液（2N H2SO4），在酶标仪上读取波长450nm处的吸光值。
抗体效价检测达到100万以上后可以对兔子进行终放血。抗体的纯化
4.抗体的亲和---亲和柱的制备
4.1 称取1mg CNBr-Sepherose 4B的琼脂糖凝胶加入2mmol／L的盐酸中，4`C过夜使其充分溶涨，可获得3ml溶涨胶。
4.2 将凝胶转移入纯化柱中，用约20ml 2mmol／L的盐酸洗介质3次。
4.3 用偶联缓冲液洗介质一次，因为活化基团在偶联缓冲液PH值下易水解，所以此步骤最好在几分钟内完成。
4.4 将溶解在5ml偶联缓冲液中的5-10mg的抗原加入凝胶中
4.5 室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜，如需测定结合效率此步骤结束后取少量溶液待测。用20ml的偶联缓冲液洗介质一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室温下孵育2小时或4`C过夜。
4.7 用磷酸盐缓冲液洗涤介质3次以上，每次15ml以上 h.
4.8抗原固相化完成，可用于纯化。
4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
5.抗血清的纯化和保存
5.1抗血清用PBS等体积稀释，5000-10000r／min离心15分钟，取上清.
5.2用10倍体积的PBS清洗抗原亲和柱以平衡柱子。
5.3将稀释好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4室温下轻轻混合摇动2-4小时，或4`C过夜
5.5用10倍体积的PBS清洗抗原柱，以洗去结合在柱子上的杂蛋白
5.6用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到特异性抗体
5.7用10倍体积PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
在得到洗脱的抗体后，经蔗糖或聚乙二醇浓缩后于PBS中透析除盐，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体OD值，所得OD值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50%甘油置于-20`C可长期保存。
多克隆抗体制备免疫小鼠 简介 多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。 流程 多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤： 1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原， 可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。 2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠 体内，观察免疫反应情况。 3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清， 获得抗体。 4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试 验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术， 对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。 关键步骤 抗原制备 抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。以下是一些常见的抗原制备方法： •纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。 •重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。 •合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。 适当的佐剂 适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的
活化。常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。 免疫小鼠免疫 将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等 方式将抗原注射到小鼠体内。注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。 血液采集和抗体收集 一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。 抗体筛选和纯化 获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进 行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。筛选出特异性较好的抗体后，可以通过亲和层析、离子交换层析等技术对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经不同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，所以称这种免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（polyclonal antibody ，PcAb）。多克隆抗体的亲和力较一般单克隆抗体高。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为制备高效价和高特异性的多克隆抗体，必须要有理想的免疫原、适宜的动物及切实可行的免疫方法。本章主要介绍多克隆抗体的制备及相关技术。 第一节动物选择实验动物是生物医学中的重要组成部分。目前常用于生物医学科学研究的实验动物种类很多，主要包括有两栖纲的青蛙、蟾蜍，鸟纲的鸡、鸭、鸽等，哺乳纲啮齿目的小鼠、大鼠、豚鼠等，兔形目的家兔，食肉目的猫、狗，有蹄目的羊、猪和灵长目的恒河猴、猩猩、绒猴等。其中最常用和用量最大的是哺乳纲啮齿目动物，其次是兔形目和食肉目等。 一、实验动物的生物学特性 实验动物选择得当与否是实验研究成败关键之一。掌握实验动物的生物学特性，则能以最佳的设计选择实验动物，进行科学实验，从而获得预期的实验结果。 1. 小鼠小鼠是啮齿目中体型较小的动物。新生小鼠 1.5g 左右，21 天断乳时12～15g，至 2 月龄体重达20g 以上，可供实验使用。成年雌小鼠体重18~35g，成年雄鼠体重20~40g。小鼠性情温顺，易于捕捉，对外来刺激敏感，喜群居于阴暗环境。 2 ．兔草食性动物，性情温顺，胆小易惊，喜居安静、清洁、干燥、凉爽、空气新鲜的环境，耐冷不耐热，耐于不耐湿。兔耳大，表面分布有清晰的血管。有特殊的血清型和唾液型，血清型分为α ' 、β ' 、α'β'和O型四种。α ' 、α' β'型易产生人A型抗体，β ' 、O型易产生人B型抗体。唾液型分两种：排出型与非排出型。排出型易获得人血细胞 A 型物质，非排出型不易获得，这种A型物质与A型抗体产生能力有关。因此，要获得A型抗体，应选用排出型的α'、α' β' 血清型兔。由于抗原刺激机体后，体液免疫应答反应强烈，故兔被广泛用于制备高效价的特异性强的免疫血清。 3 ．豚鼠草食动物，性情温顺，胆小，对外界刺激极为敏感，喜居干燥、清洁的环境。自动调节体温的能力较差，对环境温度变化较为敏感，最适宜的温度为18~20℃，对抗生素敏感。 4 ．羊草食动物，性情温顺，合群，易于接近，喜居干燥、清洁的环境，怕潮湿，怕热不怕冷，寿命为1 5 年。山羊可用于生产多种抗血清，也可用于营养学、免疫学、微生物学、生理学等方面的研究。绵羊常用作制备抗血清，其红细胞是血液学诊断中最常用的材料。 二、选择实验动物的原则 1 ．3R原则3R 指的是reduction（减少）、replacement（替代）和refinement（优化）。“减少”指减少实验用的动物和实验的次数；“替代”指尽可能采用可以替换实验动物的替代物；“优化”指对待实验动物和动物实验工作应做到尽善尽美。 2 ．从微生物学和寄生虫学标准去选择实验动物要求选用三级的实验动物，原因是三级实验动物已经排除了人兽共患疾病，排除了实验动物本身的传染病，也排除了影响实验研究的相应微生物和寄生虫，使实验研究处于没有或很少有外源干扰的情况下进行。 3 ．从遗传学的观点选择实验动物即根据动物的不同生物学特性选择适宜的实验动物。 4 ．不能忽略的一些因素如性别、年龄、体重、营养状况、饲养环境等。 三、免疫动物的选择 可作为免疫用的动物主要是哺乳类和禽类，常选用的有家兔、绵羊、豚鼠、马、鸡等。动物种类的选 择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗体的数量和用途，如制备抗γ- 免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清。具体选择时，应考虑以下因素：（一）动物种系免疫学理论研究已经证实：机体的免疫应答受遗传基因的控制。同一种系不同个体对不同抗原的免疫应答以及不同种系对同一抗原的免疫应答均不尽相同。一般认为，抗原与免疫动物种属的差异越远越好，亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔一大鼠之间，鸡-鸭之间）。实验中最常用的动物是家兔，因它与人类的交叉较少。
多克隆抗体的制备 1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。 表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。超声后10000r/min离心5min，沉淀用500μl PBS悬起，后加入400μl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100μl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。将500μl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500μl 样品）。 凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。纯化蛋白置于4℃短暂保存。 2.蛋白复性 将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。更换复性液，4℃作用2h。再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。如蛋白浓度未满足免疫浓度，可将透析袋中复性后的蛋白置于50% PEG8000溶液中进行浓缩。 3.蛋白乳化 将蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(首免)/不完全弗氏佐剂混合，用注射器来回吹打，乳化2-3h。乳化效果的检测：在水中加入一滴上述乳化液，当乳化效果良好时，液滴就聚集在一起; 如果液滴分散开来，说明乳化不完全，继续乳化，直到理想的乳化液形成为止。 4.免疫程序 多选用健康成年家兔进行免疫。新购买的家兔饲养4-5d后无异常可进行免疫。免疫接种前先采集血样，留作后续试验使用。 采用脊椎两侧背部皮下多点注射接种，每点可注入0.5ml。第一次免疫（参考剂量：2mg）后2周进行第二次免疫，第二次免疫剂量为首免的一半（1mg）。二免3-4d后可耳缘静脉采血1ml，进行血清效价检测。二免后进行第三次免疫，剂量同二免。三免3-4d后可进行血清效价检测，直到血清效价达到要求后，可进行加强免疫（剂量同前，应用PBS代替弗氏佐剂与蛋白混合），大约一周后行颈静脉放血，收集血清。 5.血清效价检测 应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中抗体水平。 a.用包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液配方：碳酸氢钠2.93g；碳酸钠1.5g pH 9.6）将纯化 后的蛋白稀释为终浓度1-10μg /ml，100μl/孔，4℃包被过夜。 b.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。5%脱脂乳（PBS配制）37℃封闭2小时，200μl/ 孔。 c.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。加入PBS稀释好的一抗（待检血清），100μl/孔； 设阴性血清对照。置于37℃作用1h。 d.200μl/孔PBST清洗3次，5min/次。加入HRP标记的二抗1：5000稀释，100μl/孔，置
实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原） 上海师范大学 实验报告 专业、年级生物科学班级姓名学号 课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期 基本原理 免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。 材料 (一)动物：健康雄性家兔2只 (二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。 (三)试剂 1.灭菌生理盐水； 2.纯化人IgG(10mg／ml)； 3.消毒酒精及碘酒； 4.弗氏不完全佐剂（FCA） 5.弗氏完全佐剂（FIA） 6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。 7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。 免疫方法
1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤； 2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称 FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。 3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。 4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。 5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另 外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。首次注射后一周或稍长时间再次进行加强注射，可大大增强免疫应答。 对免疫原性弱的抗原，需要多次注射(注射5-6次)，可以在适当的时间间隔内，有效的控制抗体效价的增加。 放血 颈动脉放血 将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。 分离血清 将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。 结果鉴定
多克隆抗体制备流程 多克隆抗体制备流程有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选 前往丁香实验 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。 抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。 抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤 多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→ 效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。 具体实验步骤如下： 1.兔子的准备 挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.
预采血（作阴性参照用） 1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静； 1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)； 1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀； 1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)； 1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口； 1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清； 1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。 2. 兔子的免疫 2.1 注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。 2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色； 2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。 2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。 3.效价检测 3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清
多克隆抗体(polyclonal antibody)制备 1. 免疫动物：两只新西兰兔 2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。 3. 免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 4. 免疫：用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。 5. 取血：用19号针头对兔子进行耳动脉取血，室温过夜析出血清。 6. 第0星期采血2ml（获得0.5-1ml免疫前血清） 完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。 第2星期 完全弗氏佐剂（CFA）混合的200μg抗原免疫兔。 第4星期 不完全弗氏佐剂（IFA）混合的100μg抗原免疫兔。
第5星期 取检测血清20-30ml 取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测， 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。 第6星期 如果检测阳性第一次采血20-30ml, 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔； 如果上次检测是阴性，取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测。第7星期 第二次采血20-30ml, 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔； 如果检测仍为阴性，需要讨论这个项目是否继续。 第8星期
第三次采血20-30ml, 溶解在生理盐水中的100μg抗原免疫兔。 第9星期 末次放血20-30ml, 纯化混合血样，平均每次纯化可以获得100-150mg抗体，最后进行ELISA和WB等质量检测。 7. 注意：在整个项目中，兔子需要保持9周的免疫和放血。检测的结果将决定这个项目的继续、修改或终止 【注意事项】 大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下： 1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。 2.第二种就是慎用，就是药物可以使用，但是要密切关注患者口服药以后的情况，一旦有不良反应发生，需要马上停止使用。 3.第三种就是忌用，就是说明药物在此类人群中有明确的不良反应，应该是由医生根据病情给出用药建议。如果一定需要这种药物，就可以联合其他的能减轻不良反应的药物一起服用。大家以后在服用药物的时候，多留意说明书，留意注意事项，避免不良反应的发生。 本文到此结束，谢谢大家!
多克隆抗体的应用及现状 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体群体，与单克隆抗体相比具有更强的多样性和高度的特异性。多克隆抗体广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域，成为重要的实验和临床工具。本文将从多克隆抗体的制备、应用以及现状三个方面进行详细介绍。 首先，多克隆抗体的制备是实现其应用的基础。多克隆抗体的制备一般包括以下几个步骤：首先，将目标抗原免疫动物（如兔、小鼠等）多次注射，刺激其产生特异性抗体。然后，从动物体内收集血清，分离抗体。接着，将抗体与大量不同的抗原冲突，筛选出特异性较高的抗体克隆。最后，对特异性较高的抗体进行扩增和提纯，得到多克隆抗体。 多克隆抗体的应用广泛涉及多个领域。在生物医学研究中，多克隆抗体常用于蛋白质表达与定位、蛋白质相互作用和信号转导的研究。例如，通过使用多克隆抗体可以检测特定蛋白在细胞内的定位和表达水平，进一步了解其功能及参与的生物过程。此外，多克隆抗体还可以用于免疫组织化学、免疫印迹和流式细胞术等实验技术，以便更全面地研究生物学问题。 在临床诊断中，多克隆抗体也有重要应用。多克隆抗体可以用于特定抗原的定量测定，如肿瘤标志物的测定、感染病原体的检测等。同时，多克隆抗体也可以用于免疫组织化学检测，辅助病理诊断。另外，多克隆抗体还广泛应用于临床病原体的荧光染色和免疫组化检测，用于快速定位和识别病原体，提高诊断效率。
在治疗领域，多克隆抗体已经取得了巨大的成功。多克隆抗体可以用于治疗多种疾病，如癌症、自身免疫疾病等。通过靶向特定抗原，多克隆抗体可以选择性地破坏癌细胞，抑制肿瘤生长和转移。此外，多克隆抗体还可以通过激活免疫系统来增强机体对疾病的免疫反应。近年来，许多多克隆抗体药物已经获得上市和临床使用，成为治疗疾病的重要手段。 然而，多克隆抗体也存在一些局限性和挑战。首先，多克隆抗体制备过程中存在批次差异，导致抗体的特异性和亲和力有一定的波动性。此外，多克隆抗体的批量生产和提纯成本较高，难以大规模应用。为了解决这些问题，近年来，单克隆抗体的发展和应用得到了快速发展。单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的抗体，具有更强的特异性和一致性。单克隆抗体已经成为当前生物医学研究和临床治疗的主流。 综上所述，多克隆抗体在生物医学研究、临床诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。随着单克隆抗体技术的不断发展和改进，预计多克隆抗体将逐渐被单克隆抗体所取代。然而，多克隆抗体作为一种重要的研究工具和药物，仍然存在一定的应用空间，并且在某些特定情况下可能仍然是更好的选择。因此，多克隆抗体的研究和应用仍然具有重要意义，在未来仍将继续发展。
睾酮多克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立 摘要:采用优化的碳化二亚胺法制备睾酮(TES)人工抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA标准曲线｡标准曲线在PBS中的线性检测范围为0.096~92.200 ng/mL,相关系数R2=0.972 2,半数抑制浓度(IC50)为 2.800 ng/mL,最低检测限(LOD)为0.035 ng/mL;抗体与去甲睾酮的交叉反应率为22.3%,与其他检测化合物的交叉反应很小或忽略不计｡羊尿20倍稀释后进行添加回收试验,其添加值与检测值的相关系数为0.985 2｡因此,该免疫学方法可用于动物尿液中睾酮残留水平的定量分析｡ 关键词:睾酮;人工抗原;多克隆抗体;间接竞争 ELISA Preparation and Its Immunoassay of Testosterone Polyclonal Antibody Abstract: A standard curve of indirect competitive ELISA (icELISA) was developed for the determination of testosterone (TES) residue in urine. The artificial antigen of TES was synthesized by carbodiimide method (EDC) and then used to immune New Zealand white rabbits for the preparation of polyclonal antibody. The results showed that the linear detecting range of the standard curve in PBS was from 0.096 to 92.200 ng/mL, the correlation coefficient (R2) was 0.972 2, the limit of detection(LOD) and IC50 value was 0.035 ng/mL and 2.800 ng/mL, respectively. The cross-reactivity of the antibody to nortestosterone was 22.3% and slight or negligible to other compounds. Under 20-fold dilution in sheep urine, a correlation coefficient of 0.985 2 between concentration added and concentration determined was observed. It indicated that this assay could be incorporated into a quantitative monitoring program for the rapid screening of TES residue in urine. Key words: testosterone; artificial antigen; polyclonal antibody; indirect competitive ELISA 类固醇激素是生物体内产生的一类调节机体代谢功能的微量物质,又称化学信息素｡此类物质有较强的蛋白质同化作用,可以提高蛋白质沉积,降低脂肪含量,从而提高饲料转化效率[1]｡睾酮是哺乳动物体内常见的具有雄激素作用的类固醇激素,它可以增加肌肉含量,提高骨骼强度,并在雄性生殖器官的发育中发挥重要作用,因而在临床医学中得到应用｡外源性睾酮也被运动员非法使用,以提高比赛成绩;养殖场使用睾酮激素后,可以提高经济效益｡然而,长期摄入睾酮类激素会导致消费者内分泌紊乱､性早熟,大大增加致癌､致畸的风险[2]｡因此,自1986年以来,欧盟委员会就禁止在肉食性动物养殖中以促进生长为目的使用自然或人工合成的激素,以保护消费者可能因食用激素的残留物或其代谢物而引起的发育问题､神经问题､遗传毒性和癌症问题[3]｡睾酮传统的理化检测方法包括液相色谱-质谱(LC-MS)[1,4]和气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)[5]等方法｡这些方法灵敏度高､特异性强,但样品前处理繁琐,不适合大批量的市场监测要求｡而免疫学检测方法建立在抗体对抗原的分子识别上,其主要优点是亲合力高､快速､简单､经济实用,能够实现对生物液体的小体积､大批量检测,逐渐成为世界各国有毒有害残留物快速检测的方法之一[6]｡ 本研究以睾酮标准品为起始反应物,经过一系列化学反应制备人工抗原,通过免
抗体的制备方法与原理 一、抗血清的制备 有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。 （一）用于免疫的动物 作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。 （二）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。 （三）佐剂 由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。 佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。 配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。 免疫佐剂
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100µg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500µl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
多克隆抗体的制备方法 多克隆抗体是由多个不同的免疫细胞（多克隆）产生的抗体混合物，可以识别并结合到目标生物标志物上。多克隆抗体在科学研究、临床诊断和治疗中具有重要的应用价值。制备多克隆抗体需要经过一系列复杂的实验流程，下面将详细介绍多克隆抗体的制备方法。 一、抗原的选择 在制备多克隆抗体时，首先需要选择一个合适的抗原。抗原通常是目标生物标志物的蛋白质或多肽片段。选择抗原的关键因素包括其表达水平、稳定性和纯度。抗原的选择直接影响到最终多克隆抗体的亲和力和特异性。 二、免疫小动物 免疫小动物通常是用于制备多克隆抗体的主要实验动物，例如小鼠、兔子、大鼠等。在免疫前需要确保小动物健康，并对其进行相应的预处理，如注射驱虫药物、进行适当的接种。还需要根据具体实验要求决定预免疫、免疫计划以及免疫方案的制定。 三、免疫过程 免疫过程是制备多克隆抗体的核心环节。首先需将抗原与适当的佐剂混合，增强免疫原性，然后用于免疫小动物。在免疫过程中需要控制免疫剂量和免疫间隔时间，以及监测动物的免疫应答情况。免疫后还需要定期采集血清样本，监测抗体滴度的动态变化。 四、细胞融合与筛选 经过一段时间的免疫后，需要从免疫动物的脾脏或骨髓中收集免疫细胞，然后与肿瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。随后采用限稀稀释法将杂交瘤细胞进行单克隆化分，筛选出高亲和力的多克隆抗体细胞株。 五、生产与纯化 经过筛选的多克隆抗体细胞株需要进行扩大培养，生产足够数量的多克隆抗体。之后通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等手段，从细胞培养上清液中纯化出多克隆抗体。 六、性质鉴定与应用 纯化后的多克隆抗体需进行性质鉴定，包括亲和力、特异性、稳定性等方面的测试。最后经过滤菌毒处理后，多克隆抗体可应用于科学研究、临床诊断、生物药物研发等领域。
白蜡虫脂酰辅酶a还原酶多克隆抗 体的制备 白蜡虫脂酰辅酶a还原酶多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，它包括了获取蛋白原料、表达和纯化等步骤。本文将对其进行详细介绍。 1. 获取蛋白原料：白蜡虫脂酰辅酶A还原酶多克隆抗体的制备需要先准备好蛋白原料。在这里，我们使用大肠杆菌作为表达宿主，构建质粒pET-28b + (N-term)，其中包含白蜡虫脂酰辅酶A还原酶的cDNA序列。将质粒插入大肠杆菌，并通过氯化钠等琼脂糖类化合物的选择压力，获得表达质粒。然后，用LB培养基培养大肠杆菌，使之进行持续表达，最后将大肠杆菌收集，分离出蛋白质悬液。 2. 纯化白蜡虫脂酰辅酶A还原酶：经过上述步骤得到的蛋白质悬液中包含了白蜡虫脂酰辅酶A还原酶，但也存在其他蛋白质。因此，我们需要进行纯化，使其纯度达到99%以上。常用的纯化方法有凝胶渗透色谱、离子交换色谱、蛋白质A纯化等。在这里，我们采用凝胶渗透色谱，将所需的白蜡虫脂酰辅酶A还原酶纯化出来。 3. 抗体制备：经过上述步骤，已经获得了纯化的白蜡虫脂酰辅酶A还原酶，接下来就是抗体的制备了。首先，
需要将白蜡虫脂酰辅酶A还原酶免疫动物，如小鼠、大鼠或其他动物，以获得较高的抗体产生率。通常地，首次免疫会给动物注射较低剂量的抗原，然后在3周后再给动物加强免疫，以获得较高的抗体产生率。最后，从动物血清中分离出抗白蜡虫脂酰辅酶A还原酶多克隆抗体。 4. 定量测定抗体：最后，可以采用ELISA法，测定分离出的抗体，以确定其纯度和效价。 以上就是白蜡虫脂酰辅酶A还原酶多克隆抗体的制备流程，从获取蛋白原料到定量测定抗体，都需要恰当的操作和充分的耐心。
将5只雌性新西兰大白 兔子先适应性喂养1周。每只动物免疫前先于一侧耳缘抽取2 mL 静脉血, 4 ℃静置过夜, 取血清作阴性对照。用福氏完全佐剂加GST2EGFP融合抗原[剂量为300 Lg, V(福氏完全佐剂): V(蛋白溶液) = 9: 10]背部皮肤皮内注射免疫动物, 每只新西兰大白兔注射2 ~ 3点, 每点注射200 LL; 第28天用福氏不完全佐剂加融合抗原, 同样剂量免疫新西兰大白兔; 第35天时再次注射; 第49天心脏采血30 mL, 4 ℃静置过夜, 取血清。采用结合有GST 的亲和层析珠除去待检血清中的GST抗体, 然后4 e 离心, 取上清。采用交联有GST2EGFP的Sepharose 24B珠纯化抗体, 4 e 翻转孵育2 h, 吸附EGFP多克隆抗体, 4 ℃离心, 取沉淀, PBS洗2次, 用2倍柱体积的洗脱液( 0. 1 mol/LTris2HC,l pH = 2. 3)洗脱, 回收的洗脱液以0. 1mol/L硼酸缓冲液( pH= 8. 5)透析过夜, 冻干备用。 兔抗猪IL22 、IL26 多克隆抗体的制备将上述纯化的蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合,充分乳化,于家兔颈部、背部多点皮下注射,剂量为1 mg 免疫原/ 只,间隔15 d ,再将纯化蛋白与等量弗氏不完全佐剂相混,充分乳化进行加强免疫,之后每周加强免疫一次。每周采血用EL ISA 方法检测抗体效价,抗体水平达到要求后颈动脉采血收集血清, - 20 ℃保存备用。 1. 2. 2抗血清的制备。①选4只2月龄、体重1. 5～2. 0 kg的健康新西兰大白兔,取1只作为阴性对照组,剩余3只为试验组。使刚买回的大白兔静养一段时间,以使其适应食物、气温及新的生活环境。②对1 #、2#大白兔注射BPAH2BSA, 3#大白兔注射DPA2BSA, 4#为阴性对照。③用Bradford法[ 8 ]测定BPAH2BSA及DPA2BSA中的蛋白质含量,并将其配成2 mg/ml的溶液。④将上述溶液与等量完全或不完全弗氏佐剂在旋涡振荡器上乳化,直至将一滴乳剂滴入水中呈现球形而不分散(如出现平展扩散即为未乳化好;乳化过的物质放置一段时间(在保存期内)出现油水分层也是未乳化好的表现)。初次免疫将乳化好的试剂(免疫抗原+完全弗氏佐剂)于大白兔背部多点注射,每只注射1 ml; 30 d后的加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化,加强免疫于肌肉注射,剂量与初次免疫相同,每14 d加强免疫1次。第4次免疫7 d后从耳缘静脉采血,采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。若效价达不到要求,继续饲养,重复加强免疫,直至获得满意的效价。效价达到要求后,单独用免疫原冲击免疫1次, 5 d后收获抗血清[ 9 ] 。 1. 4. 1提取免疫血清将提纯的表达产物与弗氏完全佐剂按1 ∶1 混匀乳化后皮下多点注射BALB /C小鼠,每只小鼠抗原接种剂量为100μg。2 周后取等量抗原与弗氏不完全佐剂进行免疫,以后每隔2周同样抗原剂量皮下注射，用ELISA法检测血清效价, 当达到一定的效价时(1∶12 800)时摘眼球提取免疫血清。 表达产物抗血清的制备 将回收的蛋白与适量的1 × PBS 混合后，取0. 2 mL(约20 μg 的抗原)腹腔注射2 只雌性BALB /c 小鼠(4 ～ 5 周龄)，在免疫小鼠之前，先采集血样，将来
多克隆抗体的制备及效价测定 多克隆抗体的制备步骤 一、器材 剪刀(剪兔毛用)一把、弯头眼科手术镊子(游离血管用)一把、直头眼科手术剪(剪血管用)一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿(直径18cm)、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。 二、试剂 生理盐水(或PBS) 弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant，FCA) 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA) 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3 三、免疫原：蛋白或KLH偶联的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。 四、兔子的选择 兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
五、免疫 用生理盐水稀释免疫原，然后与相应的佐剂进行1:1混合。抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿进行肌肉注射。每个区域大约用1/4的免疫原。这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。 注： 抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。 免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。 免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射(不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好)。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。 六、取血：